糖代谢的中心途径分析

糖代谢的中心途径Thecenterpathwaysofthecarbohydratemetabolism东南大学医学院生物工程学系徐旭东

x_xdong@126.com代谢(metabolism)：细胞内发生的各种化学反应的总称。代谢包括物质代谢和能量代谢，前者分分解代谢和合成代谢；后者分产能代谢和耗能代谢。分解代谢合成代谢第一节微生物代谢概论物质代谢能量代谢产能代谢耗能代谢初级代谢次级代谢代谢一、物质代谢物质代谢分解代谢（catabolism）合成代谢（anabolism）复杂分子（有机物）分解代谢合成代谢简单小分子ATP[H]细胞中蛋白质、核酸、糖、脂等物质的变化过程称为物质代谢。可分为分解代谢和合成代谢。++分解代谢和合成代谢的关系分解代谢往往伴随能量的产生；合成代谢往往伴随能量的消耗。糖的分解代谢脂肪碳水化合物蛋白质二、能量代谢微生物细胞中能量的产生、消耗、转移的过程称为能量代谢。用于生物合成用于运动、物质转运等三、初级代谢和次级代谢初级代谢(primarymetabolism)：微生物通过代谢合成细胞生长和繁殖所必需的化合物的的过程。初级代谢的产物称初级代谢产物，如氨基酸、核苷酸、维生素等。次级代谢(secondarymetabolism)：微生物通过代谢合成对细胞生长和繁殖作用不明显、或没有作用的化合物的的过程。次级代谢的产物称次级代谢产物，如抗生素、生物碱、毒素、色素等。四、代谢和酶1.酶是由生物细胞所产生的、具有催化性质的蛋白质；2.微生物的生命活动离不开酶；3.酶的活动受微生物调控机制制约；4.了解微生物代谢及调控机制是利用微生物的基础。微生物的分解代谢分为三个阶段：①将蛋白质、多糖以及脂类等大分子物质降解为氨基酸、单糖及脂肪酸等小分子物质(往往在细胞外进行)；②将上述小分子进一步降解为丙酮酸、乙酰辅酶A等小分子中间体（细胞内进行）；③将这些小分子中间体分解为二氧化碳。第②、第③阶段伴随着ATP、NAD(P)H+及FADH2的产生。分解代谢产生的NAD(P)H+及FADH2的H和电子通过电子传递链被氧化，产生ATP。

蛋白质多糖脂类氨基酸单糖甘油＋脂肪酸丙酮酸糖酵解CoA柠檬酸α酮戊二酸草酰乙酸阶段1阶段2阶段3CoQ细胞色素ATPNADH2+FADH2ATP+NADH2NADH2乙酰三羧酸循环ATPNADH2FADH2O2CO2NADH2第二节微生物的分解代谢及能量产生CO2一、萄萄糖分解途径（一）EMP途径(Embden-Meyerhofpathway)Embden-Meyerhof-pathway很多微生物采用基团转位的方式得到6-磷酸葡萄糖藕联基团转位Enol：烯醇EMP途径的总反应式：Glucose+2NAD++2ADP+2Pi

→

2pyruvate+2NADH·H++2ATP+2H2OEMP途径的生理意义：1.提供合成代谢必需的ATP和还原力NADH·H+；2.连接其它代谢途径的桥梁：TCA，HMP，ED等；3.通过一些代谢中间产物；4.逆向反应进行糖异生；5.与乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇发酵有关。EMP途径的关键酶：磷酸果糖激酶PFK、丙酮酸激酶PK（一）EMP途径（Embden-Meyerhofpathway）（二）HMP途径(HexoseMonophosphatePathway)HMP途径即己糖单磷酸途径，其过程包括两个阶段：一是氧化阶段：6-磷酸-葡萄糖氧化成5-磷酸-核酮糖；二是分子重排阶段：五碳糖重排成为三碳糖和六碳糖。降解发生在6-磷酸-葡萄糖酸，所以命名为己糖单磷酸途径(HMP)。5-磷酸-戊糖水平发生分子重排，所以又可以命名为磷酸戊糖途径(pentosephosphatepathway,PPP)很多微生物可以不通过TCA循环将葡萄糖彻底降解为CO2。1.HMP途径的关键酶：6磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose-6-phospoatedehydrogenase）6磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phospogluconatedehydrogenase）2.HMP途径的特征酶：转酮酶（transketolase,TK）转醛酶（transaldolase,TA）小分子前体5-磷酸-核酮糖、核糖、木糖4-磷酸-赤藓糖3-磷酸-甘油醛7-磷酸-景天庚酮糖还原力NADPH2

HMP途径可以为微生物生长提供能量、小分子前体和还原力。也扩大了碳源利用的范围乳酸杆菌(Lactobacterium)中无HMP，在其培养过程中，必须添加嘌呤、嘧啶等物质。3.HMP途径的生理意义：用于核苷酸、核酸及NAD(P)＋、FAD、FMN、CoA等合成用于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸等芳香族氨基酸的合成连接脂肪酸代谢途径，用于甘油、脂肪的合成HMP途径的总反应式不完全的HMP：完全的HMP：Glucose-6-phosphate+6NADP+

3CO2+6NADPH2+GAPGlucose-6-phosphate+12NADP+

6CO2+12NADPH2+Pi（三）ED途径(Entner-DoudoroffPathway)ED途径由Entner和Doudoroff(Russia)2人研究嗜糖假单孢菌(Pseudomonassaccharophila)中发现，故名。另外在下列细菌中也存在ED途径：Pseudomonasaeruginosa、Pseudomonasfluorescens、Pseudomonaslindneri、Zymomonasmobilis；ED途径的降解在2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(2-keto-3-deoxy-6-phosphoglucnicacid,KDPG)上发生。

ED途径是细菌进行乙醇、乳酸发酵的重要方式。philharmonicMichaelDoudoroff

(1911-1975)wasanAmerican

microbiologist

whodiscoveredwith

NathanEntnermicrobialpathwayforglucosedegradationinsomebacteria.Nowadaysitisknownas

Entner-Doudoroofpathway.HewasborninSt.Petersburg,Russiabutmovedto

SanFrancisco

whenhewas12yearsold.Heentered

StanfordUniversity

(1929)wherehecompletedhisPhDunderthesupervisionof

CorneliusVanNielatthe

HopkinsMarineStation.GlucoseGlucose-6-phosphate6-phosphogluconicacid2-keto-3-deoxy-6-phosphoglucnicacidPyruvateGAPPyruvateATPADPNAD＋NADH2H2OKDPGaldolaseED途径glucotate-6-phosphatedehydrataseglucose-6-phospoatedehydrogenase类似EMP2ATPNADH2类似HMP特征性反应1.ED途径的关键酶：6磷酸葡萄糖酸脱水酶（glucose-6-phosphatedehydratase）KDPG醛缩酶（特征酶）（2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconicacidaldolase）2.ED途径的总反应式：Glucose+NAD++NADP++ADP+2Pi2pyruvate+NADH2+NADPH2+ATP来源不同！3.如何区别ED途径和EMP途径？CHOCCCCCH2OPiOHHOOHOHHHHHCOOHCCCCCH2OPi=OHOHOHHHHGlucoseKDPGCCH3=OCCH3=OED途径呼吸的CO2来自C1和C4，EMP途径呼吸的CO2来自C3和C4pyruvateCOOHCOOHEDCCCCCH2OPiOHHOOHOHHHHHCH2OPiCCCCCH2OPi=OHOOHOHHHHGlucoseDPFCH3CCOOH=OCOOHCCH3=OpyruvateCHOEMPED途径呼吸的CO2来自C1和C4，EMP途径呼吸的CO2来自C3和C4酿酒酵母产朊假丝酵母产黄青霉大肠杆菌氧化葡萄糖杆菌运动发酵单孢菌EMPHMPED88%12%066-81%19-34%077%23%072%28%00100%000100%铜绿假单孢菌029％71%三种代谢途径在微生物中的分布（四）PK途径（phosphoketolasepathway）即磷酸酮解途径。根据降解分子的不同，又可分为磷酸戊糖酮解途径(phosphopentoseketolasepathway,PPK)和磷酸己糖酮解途径(phosphohexoseketolasepathway,PHK)即双歧途径。PK途径由Warberg、Dickens、Horeker等发现，故称WD途径。PPK途径是乳杆菌(Lactobacterium)进行乳酸发酵的重要方式；PHK途径实际上包括PPK和PHK，存在于双歧杆菌(Bifidobacterium)中。glucoseglucose-6-phosphate6-phosphogluconicacidribulose-5-phosphatexylulose-5-phosphateGAPacetyl-CoApyruvatePhosphopentoseketolase(关键酶)Glucose+NAD++ADP+Pipyruvate+CO2+Acetyl-CoA

2+3NADH2+

ATPPPK途径的总反应式ATPADPNAD+NADH2NAD+NADH2阿拉伯糖木糖核糖PPK途径类似EMP类似HMPCO2NADH22ATP2×Glucose2×glucose-6-phosphateribulose-5-phosphatexylulose-5-phosphate2GAP2acetyl-CoA2PyruvatePhosphopentoseketolase(关键酶)xylulose-5-phosphateribose-5-phosphateGAPS7PE4PF6PF6Pacetyl-CoAPhosphohexoseketolase(关键酶)PHK途径2Glucose+2NAD++3ADP+3Pi2pyruvate+3acete+2NADH2+

5ATPPHK途径的总反应式2NADH24ATP2ATPAcetateATPADP2ADPAcetate＋2ATP（五）直接氧化途径有些细菌，如Pseudomanas、Aerobacter等没有己糖激酶（hexokinase），无法进行葡萄糖的磷酸化，但是可以通过加氧酶的直接氧化作用，将葡萄糖降解。某些真菌则通过葡萄糖氧化酶完成类似的过程。加氧酶和葡萄糖氧化酶的辅基均为FAD。GlucoseGluconicacid6-phosphogluconicacidribulose-5-phosphateFADFADH2NAD+NADH2H2O2ATPADPO2H2O+O2catalaseCO2KDPGH2OHMP途径ED途径加氧酶Pseudomanas、AerobacterPseudomanas直接氧化途径NADH•H+或NADPH•H+有氧呼吸：电子或H交给O2。厌氧呼吸：电子或H交给无机物。发酵：电子或H交给糖降解产物，如丙酮酸。来自EMP、HMP、ED等途径二、围绕中心途径的发酵(fermentation)巴斯德的“发酵”定义：酵母菌在厌氧条件下进行的代谢过程。发酵的“生理学定义”是：将电子或氢交给糖降解产物的过程。

现代“发酵”的概念，已经远远超出其生理学定义：凡是利用微生物进行的产品生产过程，均称之为“发酵”。根据产物的不同，可以分为多种形式。围绕中心途径的发酵（一）乙醇和甘油发酵1.酵母菌的第一型发酵(乙醇发酵)条件：pH3.5~4.5，厌氧；关键酶：丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶；特点：H的完全平衡。总反应式：Glucose+2ADP+Pi2Eth-OH+2CO2+2H2OAcetobacter、Zymomonasmobilis、Sarcinaventriculi、Erwiniaamylovora也可进行乙醇发酵，但是以ED途径进行。CarlNeuberg

2.酵母菌的第二型发酵(甘油发酵)条件：pH中性或微酸性，添加3％亚硫酸氢钠；关键酶：α-磷酸-甘油脱氢酶、α-磷酸-甘油酯酶；特点：每个葡萄糖只产生一分子甘油，不产ATP，故亚硫酸氢钠必须是亚适量，以保证基础代谢的能量供应。总反应式：Glucose+NaHSO3

Glycerol+CO2+磺化乙醛丙酮酸CO2乙醛NADHNAD+乙醇磷酸二羟基丙酮NADHNAD+磷酸甘油甘油3%的亚硫酸氢钠（pH7）酵母菌的一型发酵（磺化羟基乙醛）酵母菌的乙醇和甘油发酵比较酵母菌的二型发酵葡萄糖EMP丙酮酸脱羧酶乙醇脱氢酶3.酵母菌的第三型发酵(甘油发酵)条件：pH7.5，厌氧；此时乙醛成为不正常的H受体，2分子乙醛之间发生氧化还原反应(歧化反应)，一个得到H成为乙醇，一个失去H成为乙酸。特点：不产ATP。总反应式：2Glucose2Glycerol＋Eth-OH+Acetate+2CO2思考：第三型发酵时培养基中添加CaCO3的重要作用？2葡萄糖2丙酮酸2乙醛乙醇乙酸EMP丙酮酸脱羧酶2CO2NADH22GAP+2DHAP4ATP4ADP4ATP+2NADH22α-磷酸-甘油2甘油酵母菌的第三型发酵第一次世界打战期间德国主要用这种方法生产甘油产量：1000吨/月目前甘油发酵使用的微生物Dunaliellasalina(一种嗜盐藻类)胞内积累高浓度的甘油从而使细胞的渗透压保持平衡生活在盐湖及海边的岩池等盐浓度很高环境葡萄糖1,6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮α-磷酸甘油甘油丙酮酸乙醛乙醇＋乙酸乙醇磺化羟基乙醛NADH2CO2②①③②③总结：酵母菌的发酵过程（二）乳酸发酵1.同型乳酸发酵关键酶：乳酸脱氢酶；特点：H的完全平衡；不产CO2。总反应式：Glucose+2ADP+2Pi2Lactate+2ATP制作酸奶、泡菜、青贮饲料，都是乳酸发酵的过程。2.异型乳酸发酵肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroids)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostocdextranicum)等以PPK的方式进行乳酸发酵。产物包括乳酸和乙酸。3.双歧途径两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)等以PHK的方式进行乳酸发酵。产物包括乳酸和乙酸。梭菌(Clostridium)、丁酸弧菌(Butyriolbrio)、梭杆菌(Fusobacterium)利用最常见。丙酮酸首先在铁氧还蛋白还原酶作用下转变为乙酰CoA，再逐步形成丁酸。（三）丁酸发酵和丙酮-丁醇发酵1.丁酸发酵总反应式：Glucose＋3ADPButyrate＋2CO2＋2H2＋3ATPCH3－C－COOHGlucoseEMPOCH3－C～CoAO2XCO2FdFdH2CoA2×2×CH3－C－CH2－C～CoAOOCH3－CH－CH2－C～CoAOHOαβCH3－CH＝CH－C～CoAOCH3－CH2－CH2－C～CoAOCH3－CH2－CH2－C－OHONADH2NAD+H2ONADH2NAD+乙酸乙酰CoA2ATP+2NADH2Pyr-Fd氧化还原酶乙酰CoA乙酰转移酶β羟丁酰CoA脱氢酶羟丁酰脱水酶丁酰CoA脱氢酶CoA转移酶丁酸发酵ATPADP英国：ChaimWeizmann阐明机理并实现发酵生产。2.丙酮-丁醇发酵总反应式：2Glucose＋5ADPButanol＋Acetone＋5CO2＋4H2丙酮丁酸梭菌(Clostridiumacetobutylicum)进行发酵时，先合成丁酸，当pH降至4.5时，产生丙酮和丁醇。估计与CoA转移酶活化有关。CH3－C－COOHO4×CH3－CH2－CH2－C～CoAOCH3－CH2－CH2－CHOCH3－CH2－CH2－CH2OHNADH2NAD+CoA丁醛脱氢酶丁醇脱氢酶NADH2NAD+CH3－C－CH2－C～CoAOOCH3－C－CH2－COOHOCH3－C－CH3OCoA转移酶脱羧酶CO2乙酸乙酰CoA丙酮-丁醇发酵发酵4×GlucoseEMP类似丁酸发酵丙酮：用于生产人造橡胶丁醇：用于生产无烟火药英国在第一次世界大战期间，有机溶剂丙酮和丁醇的需求增加。当时的常规生产方法：对木材进行干热分解，大约80到100吨桦树、山毛榉、或枫木生产1吨丙酮。1915年Weizmann发明发酵法生产丙酮-丁醇：每100吨谷物可以生产出12吨丙酮和24吨的丁醇。魏茨曼是现代工业发酵之父ChaimWeizmann(1874-1952)andEinstein/wiki/Chaim_Weizmann

Earlylifeandcareer

WeizmannwasborninthesmallvillageofMotol(Motyli,nowMotal')nearPinskintheRussianEmpire(todayinBelarus).HegraduatedtheUniversityofFribourginSwitzerlandin1899withadegreeinchemistry.HelecturedinchemistryattheUniversityofGenevabetween1901and1903)andlatertaughtattheUniversityofManchester.HebecameaBritishsubjectin1910,andinWorldWarIhewasdirectoroftheBritishAdmiraltylaboratoriesfrom1916until1919.WhilealectureratManchesterhebecamefamousfordiscoveringhowtousebacterialfermentationtoproducelargequantitiesofdesiredsubstances.

Heisconsideredtobethefatherofindustrialfermentation.

HeusedthebacteriumClostridiumacetobutylicum(theWeizmannorganism)toproduceacetone.AcetonewasusedinthemanufactureofcorditeexplosivepropellantscriticaltotheAlliedwareffort(seeRoyalNavyCorditeFactory,HoltonHeath).WeizmanntransferredtherightstothemanufactureofacetonetotheCommercialSolventsCorporationinexchangeforroyalties.（四）混和酸发酵和丁二醇发酵1.混和酸发酵埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)及沙门氏菌属(Salmonella)有2个作用于pyr的多酶复合体：Pyr脱氢酶复合体Pyr-甲酸裂解酶(厌氧条件时诱导合成，有氧时失活)。GlucosePEPPyrAce~CoAHCOOHCO2H2Ace~PiAcetateOAASuccLactatePyr－甲酸裂解酶甲酸-H2裂解酶大肠埃希氏菌：产酸产气志贺氏菌及沙门氏菌：产酸不产气Methylredtest：产酸，加甲基红，变红色混和酸发酵2.丁二醇发酵肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)及欧文氏菌属(Erwinia)具有作用于pyr的第三个酶：α-乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,AS

)。该途径中间产物3-羟基丁酮在碱性条件下，形成二乙酰，二乙酰和胍基化合物形成红色的反应。此即VP反应(Voges-Proskauertest)的原理。丁二醇发酵GlucosePyrα-乙酰乳酸HCOOHCO2H2Lactateα-乙酰乳酸合成酶甲酸-H2裂解酶Voges-Proskauertest：Enterobacter：红色Escherichia：不变色Ace~CoA3-羟基丁酮2,3-丁二醇CO2CO2NAD+NADH2二乙酰红色化合物OH－Pyr－甲酸裂解酶含胍基的化合物TCA（五）丙酸发酵丙酸细菌（Propionibacterium）可以进行该过程。1、succ-prop途径GlucosePyrEMPOAAMalFumNADH2NAD＋H2OSuccNADH2NAD＋Succ～CoA甲基丙二酰～CoA丙酰～CoACO2-BioBiotin丙酸甲基丙二酰～CoA异构酶(VB12为辅基)2、Propenoicacid途径GlucosePyrEMPD-lactateL-lactate2H2羟-丙酰CoA丙烯酰～CoA丙酰～CoA丙酸CoAH2O机制不明三、呼吸作用(respiration)NADH•H+或NADPH•H+有氧呼吸：电子或H交给O2。厌氧呼吸：电子或H交给无机物。发酵：电子或H交给糖降解产物，如丙酮酸。来自EMP、HMP、ED等途径（一）有氧呼吸(Aerobicrespiration)糖酵解(glycolysis)三羧酸循环(citricacidcycle)氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)分三步走——IRREVERSIBLEbypyruvatedehydrogenasecomplex=3enzymes：E1:pyruvatedehydrogenase,thiaminepyrophosphate(TPP)E2:dihydrolipoyltransacetylase,lipoicacid,coenzymeA-SHE3:dihydrolipoyldehydrogenase,NAD+,FAD1.三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle,TCA)（1）丙酮酸氧化成乙酰辅酶A及CO2Swingingarmfunctionoflipoicacid所有丙酮酸氧化脱羧的中间产物均紧密地结合在复合体上，活性中间产物可以通过转乙酰基酶上赖氨酸和硫辛酸形成的摆动长臂(Swingingarm)从酶的一个活性位置转移到另一个活性位置。E.colipyruvatedehydrogenasecomplex丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)，6种辅因子(TTP、硫辛酸、FAD、NAD+、CoA和Mg2+)4C1.Condensation6C2C2.Oxidative

decarboxylationto5C5C3.Oxidativedecarboxylationto4C4C5.RegenerationofoxaloacetatefromsuccinateTricarboxylicacid(TCA)cycle4.Substrate-levelphosphorylation（2）TCA循环citratesynthaseaconitaseisocitratedehydrogenaseCitricacidcyclea-ketoglutaratedehydrogenasesuccinylCoAsynthasesuccinatedehydrogenasefumarasemalatedehydrogenaseGlucose2Pyruvate

2AcetylCoA2NADH2NADH2NADH2“ATP”2FADH22NADHNetreactionof1turnofthecitricacidcycleAcetylCoA+3NAD++FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+FADH2+ATP+2H++CoA思考：1.细菌将1分子葡萄糖完全降解为CO2产生多少ATP?2.真核微生物(酵母菌)和原核微生物(细菌)相比较，将1分子葡萄糖完全降解为CO2产生的ATP数量上少2个，为什么？TCA循环的作用a.提供大量能量；b.提供大量小分子前体；c.是糖、蛋白、脂代谢的枢纽。TCA循环的关键酶a.柠檬酸合成酶(citratesynthetase,CS)b.异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,ID)c.α-酮戊二酸脱氢酶(a-ketoglutaratedehydrogenase,a-KGD)AcetylCoAoxaloacetatea-ketoglutarateFattyacidAminoacid（3）回补途径(anapleroticpathway)回补途径是微生物为补充代谢过程中消耗的中间产物而采取的一些将CO2、乙酸等物质转化为消耗的中间产物，尤其是TCA循环中间物的过程。①C1回补方式a.PEP羧化酶(PEPcarboxylase)COOHCO~pCH2+CO2+H2OPEPcarboxylaseCOOHC=OCH2COOHb.丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase)COOHC=OCH3+CO2pyruvatecarboxylaseCOOHC=OCH2COOHc.苹果酸酶(malatesynthetase)COOHC=OCH3+CO2COOHCHOHCH2COOH+ATP+H2ONADPH2+malatesynthetase②C2回补方式——乙醛酸循环很多微生物可以以乙酸、乙醇等作为唯一碳源和能源，合成草酰乙酸，完成这个过程的反应即乙醛酸循环(glyoxylatecycle)。乙醛酸循环需要3个关键酶：a.异柠檬酸裂解酶(Isocitratelyase)b.苹果酸合成酶(malatesynthetase)c.乙酰辅酶A合成酶(AcetylCoAsynthetase)乙醛酸循环总反应式：2acetate→

Malate③回补途径与苹果酸合成理论产率=134/180=74.5%理论产率=3*134/2*180=111.6%马来酸即顺丁烯二酸富马酸即反丁烯二酸苹果酸，又名2-羟基丁二酸苹果酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等，产量每年约4万吨，2013年世界总需求约为10万吨，市场潜在需求量达到每年6万吨，可见市场发展空间之大。（4）TCA相关的发酵——柠檬酸发酵柠檬酸(Citric

acid)分子式为C6H807。外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，是一种重要的有机酸，又名枸橼酸。无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。柠檬酸广泛存在于各种水果和蔬菜中，在动物的骨骼、血液、肌肉中也有分布。柠檬酸在工业，食品，化妆等行业具有广泛的用途。TCA相关的发酵包括Asp族和Glu族氨基酸发酵，合并在后面讲。NADH脱氢酶FMNCoQcytbcytccytaa3cytc1NADH2ATPATPATP真核微生物的电子传递链FADH22.氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)化学渗透学说(Chemiosmosis)原核微生物电子传递链的特点：电子供体多样化。除大多数有机物外，一些无机元素如H、S、Fe2＋、NH4＋均可作为电子供体；细胞色素多样化。不同细菌中计有a、a1、a2、b、b1、c、c1、c4、c6、d、o等；具有分支呼吸链；呼吸链组分随环境条件改变；氧化磷酸化效率低下。NAD＋NADH2NADH2脱氢酶flavoproteinFes-proteinmenaquinoneCytochromeb556Cytochromeb558CytochromeoCytochromed1/2O2H2O1/2O2H2OE.coli中的分支电子传递链在有氧和缺氧时，可以选择不同的途径。高氧环境低氧环境NAD＋NADH2NADH2脱氢酶flavoproteinFes-proteinCytochromebCytochromecXCytochromeaa31/2O2H2O1/2O2H2O分支链呼吸的P/O值仅为正常呼吸链的1/3。在柠檬酸发酵时有调控作用。Aspergillusniger中的分支电子传递链厌氧呼吸是以无机物为最终电子受体的氧化作用。进行厌氧呼吸的方式一般有：硝酸盐呼吸、硫酸盐呼吸、延胡索酸呼吸、二氧化碳呼吸等。厌氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有磷酸化作用，也能产生较多的能量用于生命活动。由于部分能量随电子转移传给最终电子受体，所以生成的能量不如有氧呼吸产生的多。（二）厌氧呼吸(Anaerobicrespiration)1.硝酸盐呼吸(nitraterespiration)硝酸盐在微生物的代谢过程中，有两种方式：一是将硝态氮(如NO3-)还原，转化为氨态氮(NH4＋)，并进一步将它转化为有机氨(R-NH3)构成蛋白质等生物大分子，称为同化型硝酸盐呼吸；二是将硝酸盐逐级还原成NO2-、N2O和N2等气态产物而逸去的异化脱氮过程，称之为异化型硝酸盐呼吸。2NO32NO22H2O[4H][HON=NOH]2H2O[4H]N2ON22NH2OH2NH3[4H][4H][2H]羟氨同化型硝酸盐呼吸异化型硝酸盐呼吸硝酸盐还原酶(受O2阻遏)硝酸盐呼吸AA进行硝酸盐呼吸的细菌被称为硝酸盐还原细菌，进行硝酸盐呼吸的都是兼性厌氧细菌，典型的如地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)等，主要生活在土壤和水环境中。硝酸盐还原细菌在无氧但环境中存在硝酸盐时进行厌氧呼吸，而有氧时其细胞膜上的硝酸盐还原酶活性被抑制，细胞进行有氧呼吸。

2.硫酸盐呼吸(sulfaterespiration)硫酸盐呼吸是微生物利用硫酸盐(SO42-)作为有机基质厌氧氧化时末端电子受体的一类特殊呼吸。它是硫酸盐异化型还原形成H2S的过程。硫酸盐在微生物的代谢过程中，也有两种方式：一是将硫酸盐还原转化为H2S，并进一步将它转化为有机硫构成蛋白质等生物大分子，称为同化型硫酸盐呼吸；二是将硫酸盐还原成S或H2S气态产物而逸去的异化脱硫过程，称之为异化型硫酸盐呼吸。同化型硫酸盐呼吸SO42－APSPAPSSO32－H2SATPATPCys、MetSer、HomSO32－AOCH2POHOH硫酸腺苷酰转移酶APS激酶PAPS还原酶SO32-还原酶APS——硫酸腺苷磷酸SO32－AOCH2POHPAPS——磷酸硫酸腺苷磷酸P异化型硫酸盐呼吸H22HHasecytC3MKcytbFdIIFrdSO42－APSSO32－H2SATPATP硫酸化酶APS还原酶SO32-还原酶H2HasecytC3FdIIFrd6H细胞膜细胞质周质空间脱硫脱硫弧菌(D.desulfuricans)中的异化型硫酸盐呼吸PAPS同化型硫酸盐呼吸微生物的不同呼吸类型根据微生物种类不同对氧的反应不同，可将微生物分为三种不同呼吸类型：①好氧性微生物；②厌氧微生物；③兼性厌氧微生物。为什么氧对厌氧微生物有有害作用？缺少以下两种酶：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)过氧化氢酶(catalase)四、自养微生物的能量转化1.自养微生物(autotrophs)的定义1887年Vinogradsky发现自养微生物，1891年硅胶平板的使用，使更多的自养微生物得以发现。Vinogradsky标准：①无机物氧化是唯一的能量来源；②CO2是唯一碳源；③不利用有机物或有机物抑制其生长。20世纪50-60年代标准：除去第三条。现代标准：具有Rubisco及RuP激酶的微生物；如：甲基营养菌。2.自养微生物的种类化能无机营养菌光能无机营养菌甲基营养菌自养微生物硝化细菌硫化细菌氢细菌铁细菌绿色细菌紫色细菌蓝细菌嗜盐细菌专性甲基营养菌兼性甲基营养菌（一）自养微生物的能量转化方式1.化能无机自养菌(chemolithoautotroph,CLA)化能自养微生物从无机物的氧化中获得能量，并能以CO2作为主要碳源或唯一碳源进行生长。化能自养微生物都是好氧性细菌，根据它们生长时提供能源的无机物类型不同，可以将它们分成硝化细菌、硫化细菌、铁细菌和氢细菌4种类型。真正属于专性化能自养菌的种类并不多，不少种类属于兼性自养或混合营养型。专性化能自养菌并非绝对不吸收有机物，而是能不同程度地同化有机物，进而将其转化为细胞物质。但化能自养菌吸收的有机物不是作为能源，且数量有限，也不能代替CO2作为主要碳源。化能自养菌通过氧化无机物获得能量供其生长。其产生ATP的途径仍为电子传递磷酸化和底物水平磷酸化两种。亚硝化细菌的能量获得方式膜氨单加氧酶(AMO)/羟胺氧化还原酶(HAO)/氨氧化细菌(AOB)硝化细菌的能量获得方式NH3、NO2-的氧化还原电势均比较高，以氧为电子受体进行氧化时产生的能量较少，而且进行合成代谢所需要的还原力需消耗ATP进行电子的逆呼吸链传递来产生，因此这类细菌生长缓慢，平均代时在10h以上。还原力的获得方式——电子传递逆转硫细菌的能量获得方式

H2S→S0→SO32–→SO42–

硫细菌也是通过电子的逆呼吸链传递来生成还原力。S2-S2O32-硫化物氧化酶氰化酶2H[S]O24ATPH2O4H3H2O硫氧化酶SO32-1/2O22ATPH2O2HAMP+2H+APS还原酶SO32-亚硫酸盐-细胞色素C还原酶SO42-APS2-SO42-PiADP硫化酶ADP1/2ATP1/2AMPPi腺苷酸激酶硫化菌氧化硫化物形成SO42-和产生ATP的基本过程H2O2H1/2O22ATPH2O2Fe2+2Fe3+RCCytCCyta11/2O2+2H+H2O周质空间PH4.5pH6.5pH2细胞膜细胞质2H+CytCADP+piATP氧化亚铁硫杆菌氧化Fe2+的过程中的电子传递氢细菌的能量获得方式颗粒状氢化酶可溶性氢化酶氢细菌含有两种与H2氧化有关的酶：一种为不需NAD+的颗粒状氢化酶，它是含6个铁原子和不稳定硫的铁硫蛋白，分子量≤90000。它结合在细胞质膜或壁膜间隙中。其作用是合成ATP。另一种是需要NAD+的可溶性氢化酶，它是一种寡聚铁硫黄素蛋白，分子量约200000，含有几个[2Fe-2S]、[4Fe-4S]中心和FMN，酶呈自由态溶于细胞质中。其作用是催化H2氧化形成NADH2，用于还原CO2。应用：1.硫杆菌产生的降解煤与石油中的无机及有机硫化物，以减轻酸雨的污染；2.硫杆菌产生的H2SO4可以使不溶性的CaCO3转换成溶解度较大的CaSO4；3.利用硫杆菌产生的H2SO4溶解磷矿粉，增加磷矿粉的肥效；4.利用硫杆菌产生的H2SO4抑制非耐酸微生物的污染；5.最重要的应用是硫氧化细菌可以与铁细菌一起特别是氧化亚铁硫杆菌可以被用于细菌浸矿。2.光能无机自养菌(photolithoautotroph,PLA)光合微生物主要分为3大类群：绿色细菌、紫色细菌(分着色细菌和红螺细菌)和蓝细菌。细菌的光合色素主要为细菌叶绿素(Bacteriochlorophyll,B-Chl)，它的分子结构与高等植物相近。

环式光合磷酸化(cyclicphosphorylation)非环式光合磷酸化(noncyclicphotosphorylation)比较项目原核生物绿藻及高等植物紫细菌绿细菌蓝细菌含有光合器

的细胞结构细胞膜色素囊类囊片和

藻胆蛋白类囊片光合系统Ⅰ十十十十光合系统Ⅱ——十十同化CO2

的还原剂H2S，H2，或有机质H2S，H2H2OH2O光合作用

的主要碳源CO2或有机质CO2

或有机质CO2CO2氧的产生－－＋＋3.嗜盐菌(Halobacterium)嗜盐细菌属于极端微生物，它不含叶绿素或细菌叶绿素，依靠其特有的菌视红质(Bacteriorhodopsins)进行光合作用。盐生盐杆菌(Halobacteriumhalobium)在低氧浓度下形成的菌视红质是由7个α螺旋构成的穿膜结构，在560nm具有强烈的光吸收，而后驱动质子泵将质子抽到细胞膜外，造成内外质子的浓度差，从而形成ATP。嗜盐细菌的能量获得方式在海洋和淡水水体中，有一些细菌能发光。在一定条件下，发光细菌能将细胞内贮存的化学能转化为光能。如海洋细菌中的费氏发光杆菌(Photobacteriumfischeri)就具有发光能力。发光机理：在特定条件下，发光细菌可在细胞内累积的某种物质的诱导下产生荧光素酶，该酶在有氧和长链脂肪醛(C12～14)存在的条件下，催化黄素单核苷酸(FMNH2)氧化，伴随产生发光反应。发光后的产物为氧化型黄素单核苷酸(FMN)、长链脂肪酸和水。荧光素酶是细菌发光反应的关键酶，生物发光淀粉、纤维素、果胶、蛋白质、核酸等大分子化合物，必须在体外降解成可吸收的小分子单体，才能被微生物利用，这一过程不产能，但是为氧化还原做了准备。（一）淀粉的降解淀粉有直链淀粉和支链淀粉之分。直链淀粉是以葡萄糖单体以α-1,4糖苷键连接而成；支链淀粉除了含有α-1,4糖苷键，还有分叉的α-1,6糖苷键。五.大分子化合物的降解glucoseglucose

α-1,4糖苷键淀粉的分解：是由微生物产生的淀粉酶催化完成的，因为淀粉是由许多葡萄糖分子聚合而成的，所以最终把淀粉分解，产生葡萄糖、麦芽糖等。主要淀粉酶的作用方式Starchdegradationbyamylolyticenzymes.Theopenandblackcolouredcirclesrepresentthereducingandnon-reducingsugars,respectively.Notethatthecleavageoccursatthereducingsugar.该酶攻击淀粉分子内部α-1，4糖苷键，但对α-1,6糖苷键及靠近α-1,6糖苷键的α-1,4糖苷键无作用。作用的结果是产生麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。从非还原性末端开始以双糖为单位水解α-1,4糖苷键，但β-淀粉酶不水解α-1,6糖苷键，遇到此键，作用停止。水解的终产物是麦芽糖、极限糊精(当支链淀粉水解一半时，反应停止时的剩余部分)及带分支侧链寡糖。

β-淀粉酶α-淀粉酶(α-amylase)

从非还原末端开始，依次以葡萄糖为单位水解α-1,4糖苷键，不水解α-1,6糖苷键，但能越过此键作用α-1,4糖苷键，作用产物是葡萄糖和带有α-1,6糖苷键的寡糖。水解淀粉中的α-1,6糖苷键。它能水解α-淀粉酶和β-淀粉酶水解后的产物极限糊精，作用产物是葡萄糖。

葡萄糖淀粉酶淀粉-1,6-转葡糖苷酶(异淀粉酶)支链淀粉直链淀粉表示带有还原基的葡萄糖残基Reducingtermini

Reducingtermini（二）纤维素的降解纤维素是地球上最丰富的多糖类化合物，是由许多葡萄糖分子聚合而成的长链大分子。许多微生物能够分泌分解纤维素的酶，土壤微生物产生的纤维素酶分解农作物秸杆，最终产生葡萄糖。天然纤维素短链纤维素葡萄糖纤维二糖纤维寡糖纤维二糖葡萄糖C1酶C2酶β-葡萄糖苷酶按照纤维素酶的作用机理一般也可以将其分为三类：(1)内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase,(EC,也称Cx酶);(2)外切β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase,EC1,也称C1酶);(3)纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,EC2.1.21,简称CBH)。果胶质的分解：果胶质是构成植物细胞间质的主要物质，分解果胶的微生物主要是一些细菌和真菌，分解果胶质后产生一些有机酸和醇类化合物。几丁质的分解：几丁质又称甲壳质，是真菌细胞壁和昆虫体壁的组成成分，也是甲壳类动物，如虾、蟹的外壳主要成分。它们是不易被分解的含氮多糖物质，一般生物都不能分解它，只有一些细菌和放线菌能分解和利用它。几丁质首先被几丁质酶分解成为甲壳二糖，后者被甲壳二糖酶分解成为N-乙酰氨基葡萄糖。（三）其他生物大分子的降解淀粉与几丁质的结构StarchChitin半纤维素的分解：半纤维素的结构与组成随植物的种类或存在部位不同而异，微生物分解半纤维素的酶也多种多样。半纤维素分解后产生木糖、阿拉伯糖等等。木质素的分解：木质素是植物体内含量仅次于纤维素和半纤维素的一个组分，一般占植物干重的15～20%，在木材中可占30%左右。木质素的化学结构非常复杂，但在自然界中，仍然有一些微生物能够分解该类物质，其中，以担子菌的分解能力最强。担子菌分解木质素时，还常同时分解纤维素、半纤维素等物质。脂肪的分解：微生物对脂肪的分解主要依赖于脂肪酶的作用，产生甘油和脂肪酸。在有氧条件下，脂肪酸可被彻底氧化成乙酰辅酶A，并释放出大量能量。蛋白质的分解：蛋白质是由氨基酸组成的大分子量的化合物，种类繁多。微生物中产生的蛋白酶可将蛋白质分解为片段较小的肽，然后再由肽酶将肽分解成为氨基酸。微生物产生的蛋白酶大多数可以分泌到细胞外面，称为胞外酶，但肽酶有胞外酶，也有不向外分泌而只存在于细胞内的胞内酶。微生物也能分解组成蛋白质的氨基酸，形成胺类和醇类。柠檬酸(Citric

acid)分子式为C6H807，易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有机溶剂，它天然存在于果实中。柠檬酸主要用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、风味增进剂、胶凝剂、调色剂等。柠檬酸1784年由Scheels发现，1893年Wehmer发现二种青霉菌可以生成柠檬酸，1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸，1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸的深层发酵研究，1951年美国Miles公司首先以淀粉质为原料，经水解后深层发酵大规模生产柠檬酸。第三节有机酸发酵一、柠檬酸发酵(酶学水平的调控)我国1953年采用浅盘法发酵生产柠檬酸，1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，至20世纪70年代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系：产量位居世界第一；技术上处于世界领先水平，其优势：1.发酵采用的菌种(黑曲霉)具有双重功能，采用边糖化边发酵工艺，降低了生产成本。2.柠檬酸的产酸速度大大高于国外水平，平均产酸速率是国外的2倍。

（一）柠檬酸发酵概述柠檬酸的消费领域：饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其它占10％我国是世界上最大的柠檬酸生产和出口国，柠檬酸年产能已经达到百万吨，占世界的70％左右；年产量达70余万吨，约占世界的65％；年出口量50万吨，超过世界贸易总量的一半。主要出口到印度、美国、欧洲、日本等地。在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨。（二）柠檬酸发酵微生物

在固体培养基上，黑曲霉菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。1.黑曲霉(Aspergillus

niger)的形态特征

目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为