流式细胞仪分析技术及应用优秀课件

第十七章

流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。采用激光作为激发光源，利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，一、工作原理（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构：由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流（1）液流系统喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（2）光学系统主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。二、散射光的测定

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光示意图 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群

荧光补偿参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术第二节数据的显示与分析FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、参数单参数直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析直分析方图设门分析:REGION和GATE设置二、数据显示方式由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图单参数直方图细胞相对数量信道(channel)1.双参数直方图点图绿色荧光强度红色荧光强度双参数直方图点图多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术A淋巴细胞B单核细胞C中性粒细胞A、B、C均为任意门线性门Region设置:

区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。

样本制备标记染色液相芯片技术质量控制第四节流式细胞仪免疫分析的技术要求

外周血淋巴细胞样品的制备 分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化机械吹打使贴壁细胞脱落 洗涤尼龙网过滤单细胞悬液一、免疫检测样品制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）适用条件:有较高的量子产额和消光系数对488nm的激发光波长有较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光染料与标记染色FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷5藻红蛋白能量传递复合染料机制第四节在免疫学检验中的应用T淋巴细胞及其亚群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析

B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关 B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示对化疗药物耐药四、肿瘤耐药基因分析五、AIDS病检测中的应用HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相关HLA抗原分析

FCM作为一