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实验四、植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应一、实验目的（一）掌握分光光度法测定过氧化氢酶的方法；（二）重金属对过氧化氢酶的影响及其机理。酶：由活细胞产生的具催化功能的蛋白质；酶催化底物发生的生物化学反应（酶促反应）；

2H2O22H2O+O2

过氧化氢酶(catalase)

干旱、重金属等环境胁迫下植物机体内容易产生ROS（ReactiveOxygenSpecies）如：O2-、H2O2、OH-等，因此激发保护酶体系（过氧化物酶POD、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶（CAT）清除自由基，提高抗逆性。几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶，其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞及某些组织内的过氧化体中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的OH-。二、实验原理Cu2+使植物体内活性氧代谢加强，H2O2积累，使细胞受害，而过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶防御系统之一。植物体内H2O2含量，过氧化氢酶活性与植物抗逆性密切相关。H2O2在240nm具有强烈吸收峰。四、实验方法和内容前处理浸种催芽培养（木村B培养液，20℃培养至2叶1心）处理（对照和2.0mMCuSO4处理）1.酶液的提取称取新鲜水稻叶片0.5g置于研钵中，加入2-3ml4℃预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中。用缓冲液冲洗研钵数次，并合并冲洗液，定容。容量瓶于4℃冰箱中静置10min，取上清液在4000rpm下离心10min，上清即为粗酶液。2.测定取10ml试管3支，其中2支为样品管，1支为空白管，按表1加入试剂。表1紫外分光光度法测定H2O2样品配置表mlS0S1S2粗酶液0.20.20.2磷酸缓冲液1.51.51.5蒸馏水1.01.01.0H2O20.30.30.3对照管：煮沸3-5min;样品管25℃预热5min样品管25℃预热后，逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4次。对照管在煮沸5min后加入H2O2，并测定。等3支试管测定完后按下式计算酶活性。3.结果计算式中AS0－加入煮沸酶液的对照管吸光值；AS1，AS2－样品管吸光值；VT－粗酶提取液总体积（25ml）；V1－测定用粗酶液体积（0.2ml）；FW－样品鲜重；0.1－A240每下降0.1为1个酶活力单位；t－从加过氧化氢到最后一次读数的时间（3min）

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