高职工业微生物学11

微生物的遗传和变异微生物的变异现象形态和结构的变异毒力变异耐药性变异菌落变异第1页，共77页。遗传（heredity）：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和。是一种内在可能性或潜力。表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。第2页，共77页。变异：在一定条件下，子代和亲代之间以及子代和子代之间的差异称为变异。表型饰变：无基因结构改变。a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；b.性状变化的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。基因型变异：基因结构发生可稳定遗传的改变。

a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）；b.性状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定的，可遗传的。第3页，共77页。第一节微生物遗传的物质基础DNA是遗传变异的物质基础的证明1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。第4页，共77页。一、遗传变异的物质基础的实验证明（一）转化实验第5页，共77页。第6页，共77页。（二）噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年第7页，共77页。（三）植物病毒的重建实验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。第8页，共77页。选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）­蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）­蛋白质（TMV）。用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状，并分离到正常TMV粒子;（2）表现HRV的典型症状，并分离到正常HRV粒子。第9页，共77页。二、遗传物质在微生物中的存在形式（一）核物质——染色体真核微生物的染色体DNA：线状双链DNA分子DNA+蛋白质=染色体（分裂期）/染色质（分裂间期）DNA中包含非编码序列（内含子），编码序列（外显子）被内含子分隔开。通常含有多条染色体，且每条染色体含有多个复制起始点，可同时进行复制。第10页，共77页。染色体的结构第11页，共77页。原核微生物的遗传物质DNA：共价闭合环状的双链DNA，在细胞中紧密缠绕成较致密的不规则小体，称为拟核，也称染色体，其上有类组蛋白和少量RNA分子结合。双向滚环复制方式病毒和噬菌体DNA或RNA第12页，共77页。（二）核外物质——质粒（1）质粒的特点质粒：质粒是微生物染色体外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA，能自主复制，亦能整合入宿主细胞染色体中，随染色体复制而复制，此时称为附加体。具自我复制能力，为复制子，单拷贝或多拷贝紧密型质粒：复制受核控制松弛型质粒：复制不受核控制第13页，共77页。可分为相容性和不相容性编码产物赋予细菌某些性状特征可自行丢失与消除有转移性第14页，共77页。（2）常见的质粒类型致育质粒（F质粒）与接合有关带有F质粒的为雄性菌，能长出性菌毛；无F质粒的为雌性菌，无性菌毛耐药性质粒（R质粒）：编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。可通过细菌间接合进行传递的称接合性耐药质粒不能通过接合传递的称非接合性耐药质粒，可通过噬菌体传递，又称r质粒。第15页，共77页。细菌素质粒编码各种细菌产生的细菌素。Col质粒编码大肠埃希菌产生大肠菌素代谢质粒编码产生相关的代谢酶。沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的；假单胞菌属中的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码。例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒等。第16页，共77页。（三）转座因子转座因子：存在于细菌染色体或质粒DNA分子上的一段特异性核苷酸序列片段，它能在DNA分子中移动，不断改变它们在基因组的位置，能从一个基因组转移到另一个基因组中。插入序列（insertionsequence,IS）转座子（transposon,Tn）转座噬菌体第17页，共77页。1.插入序列（insertionsequence,IS）分子量很小（仅0.7~1.4kb），只有引起转座的转座酶基因而不含其它基因，具有反向末端重复序列。已在染色体、F因子等质粒上发现IS序列。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS被切离时引起的突变可以回复，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。TransposaseABCDEFGGFEDCBA第18页，共77页。2.转座子（transposon,Tn）转座子又称转位子或易位子。分子量居中（一般为2~25kb）。除了与转座作用有关的基因外，还含有抗性基因（对抗生素、某些毒物）、乳糖发酵基因等几个至十几个基因。Tn有两种类型，即末端为顺向重复的IS，或末端为反向重复的序列。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但并不完全是随机的，某些区域更易插入。IS

ISResistanceGene(s)IS

ISResistanceGene(s)第19页，共77页。3.转座噬菌体或前噬菌体转座噬菌体（Mu噬菌体）即诱变噬菌体，是一种温和噬菌体。含有噬菌体生长繁殖和转座所必需的基因，其分子量最大（39kb），含有20多个基因，但并没有固定的整合位置。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。第20页，共77页。（4）转座的遗传学效应插入突变插入位置出现新的基因基因的移动和重排产生染色体畸变切离可导致回复突变第21页，共77页。三、DNA的复制方式半保留复制双链DNA解旋，在复制起点形成复制叉。生物体内单个复制单位——复制子；一个复制子只有一个起点。第22页，共77页。基因变异的机制基因的突变基因突变的规律

基因的转移与重组供体→转移→受体→重组→基因整合方式：转化、接合、转导、真核生物的基因重组第23页，共77页。第二节基因突变及其机制一、基因和性状（一）基因的概念和基因符号基因为遗传单位，为一条多肽或RNA分子合成编码所必须的完整的一段核苷酸序列。基因符号：代表某基因的英文符号。（二）性状和表型及基因组和基因型性状：构成一个生物体的有关结构、形态、物质和功能的各方面特征的总和。表型：特定条件下表现出来的某种生物学特点。基因组：一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。基因型：基因组的核酸序列。第24页，共77页。二、基因突变基因突变：突变（mutation）是微生物某些遗传物质发生突然而稳定的改变，DNA上的碱基对的变化使基因发生变化。突变率常在10-6~10-9范围内。基因突变（点突变）：细胞学上看不到遗传物质的变化。染色体畸变：细胞学上可以看到染色体的变化。基因突变的原因自发突变诱发突变第25页，共77页。（一）基因突变的类型1.营养缺陷型营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。野生型：自然界分离到的微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。原养型：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。第26页，共77页。第27页，共77页。2.抗性突变型因基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异菌株。3.形态突变型由于突变而产生的个体或菌落形态发生的非选择性变异。4.条件致死突变型在某一条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖的突变类型。如温度敏感突变株（Ts）。其他突变型第28页，共77页。（二）突变的规律自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。稀有性：突变率低且稳定。可诱发性：诱变剂可提高突变率。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变（forwardmutation），相反的过程则称为回复突变或回变（backmutationreversemutation）。第29页，共77页。（三）证明突变自发性的经典实验变量实验：1943年，Luria和Delbruck根据统计学的原理设计。抗噬菌体突变发生在接触噬菌体之后，则无论先分散还是后分散，突变的频率都应相同，平板上的抗性菌落数目应基本一致；而如果突变发生在接触噬菌体之前，因为突变率极低，先分散后培养，在培养中发生突变的时间不同，突变细胞繁殖的代数也不同，各皿的突变细胞数量就有很大差异了；而先培养后分散，突变细胞繁殖的后代均匀散布在整个容器中，分散时自然是均匀的，所以各皿的突变菌落数基本相同。第30页，共77页。平板影印培养试验（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫妇的论文《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。第31页，共77页。第32页，共77页。第三节基因的转移与重组定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。基因重组是杂交育种的理论基础。第33页，共77页。原核生物的基因重组1.转化：细菌接受其他细菌的DNA片断并与自身DNA重组2.转导：由噬菌体携带的DNA片断浸染其宿主细菌3.接合：供菌和受菌直接接触而传递大片断DNA4.噬菌体转变：噬菌体自身DNA与受染菌DNA发生重组第34页，共77页。一、转化转化是供体菌裂解游离的DNA片段被受体菌直接摄取，使受体菌获得新的性状。受体菌：转化基因的接受者供体菌：转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：将转化基因重组进入自身染色体组的重组子细菌转化所用的DNA来源于病毒者称为转染。第35页，共77页。第36页，共77页。转化发生的条件受体细胞要处于感受态。感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1×107D左右。菌株间的亲缘关系密切。转化的类型自然遗传转化人工转化原生质体转化第37页，共77页。感受态概念：细胞能够接受外源DNA的状态。出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。感受态细胞的特征：细胞表面正电荷增加细胞壁通透性加大细胞表面分解DNA的能力增强第38页，共77页。转化的过程双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的DNA结合位点（主要在新形成细胞壁的赤道区）结合；在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为4~5×106的DNA片段；DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5×105的DNA片段不能进入细胞。第39页，共77页。来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对交换，形成了一个杂合DNA区段。在这一过程中，有核酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的参与；受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。第40页，共77页。第41页，共77页。降解吸附切割成4~5×106单链入胞同源部分配对、整合复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因非转化子转化子第42页，共77页。二、接合供体菌与受体菌直接接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子革兰阴性菌通过性菌毛进行结合；革兰阳性菌通过分泌类似性激素的短肽刺激细胞结合，第43页，共77页。第44页，共77页。F因子转移的机制根据F因子在E.coli中的有无，及与染色体的关系，可将E.coli分为四种类型：F－菌（雌性菌）细胞中不含有F因子，细胞表面不具有性菌毛。可以通过与F+、F’或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、F’因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、F’菌株或重组子。据估计，从自然界分离到的2000株E.coli中约有30%是F–菌株。第45页，共77页。F+（“雄性”）菌株：细胞内含有（1~4个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。与F–相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F–细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。Hfr（高频重组，highfrequencyrecombination）菌株含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F–接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。第46页，共77页。F′菌株：细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F–菌株接合，使其成为F′菌株。F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时形成，并因此造成细胞染色体发生缺失，F因子也缺失一段DNA。第47页，共77页。F质粒的接合机制接合时F+细胞与F–细胞相遇，性菌毛与F–细胞表面发生吸附而形成接合管。F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂。断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板进行滚环复制。在F–细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链F因子。第48页，共77页。第49页，共77页。F’F’F’F’F’F-F’F-F′

第50页，共77页。第51页，共77页。R质粒的接合日本首先分离到抗多种药物的宋内志贺菌多重耐药株，多重耐药性很难用基因突变解释。R质粒与耐药性有关，尤其与多重耐药性有关。耐药质粒从一个细菌转移到另一个细菌中。健康人中大肠埃希菌30%~50%有R质粒，而致病性大肠埃希菌90%有R质粒。第52页，共77页。三、转导（transduction）通过噬菌体，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子（transductant）普遍性转导（generalizedtransduction）局限性转导（restrictedtransduction）第53页，共77页。普遍性转导通过噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。被包装的DNA可以是供体菌染色体上的任何部分。第54页，共77页。流产普遍性转导受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，第55页，共77页。局限性转导通过温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）该特定基因由噬菌体携带该噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约10–5）“误切”，或由于双重溶原菌的裂解而形成第56页，共77页。局限性转导第57页，共77页。普遍性转导与局限性转导的比较比较项目普遍性转导局限性转导转导的基因供体染色体或染色体外的任何基因供体染色体上与原噬菌体紧密连锁的少数几个个别基因噬菌体寄生的位置不结合在寄主染色体特定位置上结合在寄主染色体特定位置上获得转导噬菌体的方法通过敏感菌的裂解或容源菌的诱导紫外线诱导容源菌转导子的区别一般稳定，非溶原性（不表现出任何噬菌体的性状，包括免疫性）一般不稳定，呈缺陷溶原性（对同源噬菌体具有免疫性，但不表现出其它噬菌体的性状）第58页，共77页。四、溶原性转换前噬菌体整合入宿主菌的染色体后，宿主菌获得新的表型特征。也称溶原转变。与转导不同：温和噬菌体转移的非其它细菌的基因而是噬菌体自身的基因；获得该性状的是溶原性宿主菌；获得的性状可随噬菌体的消失而消失。第59页，共77页。第九章菌种的选育与保藏一、微生物生产菌种的来源二、自然选育、诱变育种、杂交育种三、菌种保藏第60页，共77页。菌种选育目的：改良或改变菌种的特性，使其符合工业生产或研究的需要。包括变异、筛选、表达三个环节。第61页，共77页。第一节微生物生产菌种的来源一、购买菌种二、自然界来源的微生物菌种筛选样本采集富集培养纯种分离菌种筛选菌种鉴定第62页，共77页。利用菌种自发突变进行菌种选育。纯化菌种、稳定生产、提高发酵产量方法：单菌落分离法菌种制成单孢子悬液或单细胞悬液，经过适当稀释后在琼脂平板上分离。然后挑选单个菌落进行生产能力测定，从中选出优良的菌株。第二节自然选育第63页，共77页。第三节诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。第64页，共77页。一、突变的诱发（一）菌种的斜面选取对诱变剂最敏感的已知最佳培养基和培养条件（二）单孢子悬液制备（三）孢子计数计算诱变致死率。（四）单菌落分离分离的孢子液涂布均匀后培养。第65页，共77页。二、突变株的筛选筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；——因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；——复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。第66页，共77页。以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：第67页，共77页。第一轮：一个出发菌株→→→→选出200个菌株→→→→→选出50株→→→→→选出5株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：5个出发菌株→→→→→→→选出50株→→→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）选出5株→→→→复筛（每瓶四株）第68页，共77页。突变株的筛选方法随机筛选摇瓶筛选法琼脂块筛选法理化性筛选运用遗传学、生物化学原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法。第69页，共77页。第六节菌种保藏目的：存活，不丢失，不污染防止优良性状丧失随时为生产、科研提供优良菌种原理选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突