实验十DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离

实验十DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离第1页/共22页实验十ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离

DNAfragmentrecoveryfromtheagrosegel第2页/共22页一．实验目的及背景在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列，分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开，这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等.第3页/共22页从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法现在常用的技术有：电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法ＤＥＡＥ滤膜插片法等其中电洗脱法，经济节省，操作方便，对ＤＮＡ的回收效果好。第4页/共22页低熔点琼脂糖凝胶法

65oC琼脂糖凝胶熔点

低熔点琼脂糖凝胶37oC液体第5页/共22页ＤＥＡＥ滤膜插片法HighefficientDNAhighqualityformicroinjection<5kbfragment100ngDNAfragment10mmol/LEDTA(pH8.0)5minutes0.5mol/LNaOH5minutes低盐缓冲液50mM/LTris.Cl0.15M/LNaCl10mM/LEDTA(pH8.0)高盐缓冲液50mM/LTris.Cl1M/LNaCl10mM/LEDTA(pH8.0)第6页/共22页电洗脱法基本原理将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切割下来，装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中，由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液，进一步用酚、氯仿抽提纯化。第7页/共22页二．实验试剂及仪器NaHCO32%EDTA-Na20.01MTBE电泳液10.8gTris碱0.93gEDTA5.5g硼酸调pH8.2定容1000ml琼脂糖透析袋

ＴＥ酚氯仿乙醇第8页/共22页三、实验方法

一、透析袋的处理：１．切取适当长度适析袋。２．在２％NaHCO31mMEDTA溶液中煮沸１０分钟。３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。第9页/共22页二、电洗脱１．在长波紫外灯下（３００－３６０nm）将含目标ＤＮＡ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行），加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全部移出凝胶。５．改变电场方向继续通电１分钟。６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５mlEppendorf管中。第10页/共22页７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。８．在台式离心机上最高速２分钟。９．吸去上层，正丁醇溶液。１０．重复７，８，９二次。１１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。１２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3MNaAc２倍体积预冷无水乙醇，于２０℃过夜。第11页/共22页１３．12000g，4℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。１４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。１５．加入５０μlＴＥ溶解ＤＮＡ。１６．取１０μlＤＮＡ溶液加入2μlLoadingbuffer于０．８％琼脂糖上，４０伏电泳，３小时。１７．在紫外透射仪上观察结果。１８．测定ＤＮＡ溶液OD260,OD280值。第12页/共22页结果与分析

１．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。２．记录电泳结果问题与讨论：１．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１分钟？２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？第13页/共22页玻璃奶法快速纯化回收DNA片段

本方法有多种用途，主要包括：从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段；从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段；从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）；DNA浓缩、去盐及去除杂质。本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒，能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。第14页/共22页使用本法回收DNA片段有以下优点：高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；简便：所需主要仪器是一架台式离心机；快速：整个回收过程只需半个小时；高效：回收得率达到70%以上；多用途：可以同时作胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等；安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。第15页/共22页二、试剂盒组成

1．碘化钠溶液：50ml2．DNA洗涤液（20倍浓缩液）：10ml3．“基因纯”试剂：1ml4．超纯水：1ml使用前，将DNA洗涤浓缩液（10ml）倒入一玻璃瓶中，加140ml无水乙醇及50ml蒸馏水（由使用者自配），混匀后置于-20℃冰箱中，其余溶液置于4℃冰箱。第16页/共22页三、操作步骤

从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段a.常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭（EB）染色DNA，而后将欲分离的DNA带从胶上切割下来，置于一1.5ml离心管中。b.称出凝胶带的重量，加入三倍量（V/W）的碘化钠溶液。（如0.1g凝胶中加入0.3ml碘化钠溶液）。c.置于55℃水浴5-10分钟，直至凝胶完全溶化。d.加入20ul充分混匀的“基因纯”试剂（建议使用前用漩涡振荡器振荡3分钟），室温放置5分钟（期间不时将管子颠倒几次以混匀）。第17页/共22页e.离心10秒（10,000rpm），倒去上清液。f.加0.8ml刚从冰箱中取出的DNA洗涤液，充分摇匀，离心10秒，去上清。g.重复步骤f两次（共洗涤三次）。h.用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。i.加入20ul超纯水，混匀后置于55℃水浴5分钟。j.离心3分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。第18页/共22页注意事项：溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。步骤h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去，可能导致“基因纯”试剂上结合的DNA无法由蒸馏水洗脱。第19页/共22页PCR反应物中纯化目的DNA片段

PCR反应完毕后，加蒸馏水至100ul（最后体积）。加入300ul碘化钠溶液，混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d