专题 基因工程

专题基因工程第1页/共113页目录胚胎工程生物技术的安全性和伦理问题生态工程专题3基因工程专题1专题4专题5专题5细胞工程专题2第2页/共113页期末成绩70%20%60%20%平时成绩专题综述实验成绩实验报告

实验操作，打扫卫生，考勤期末每人写一篇综述不得成段抄袭不定期的课后作业，制作ppt到课情况实验课时间第5,12,13,14周，周六全天第3页/共113页专题1基因工程第4页/共113页基因工程的诞生过程19441950~19581963~1966DNA双螺旋结构和中心法则的确立

1950.查哥夫（E.Chargaff）法则

1953.沃森

(J.D.Watson)&克里克(F.Crick)

1958.梅塞尔松

&斯塔尔DNA半保留复制遗传密码的破译

1963.尼伦伯格&马太

1966.霍拉纳DNA是遗传物质的证明

1928.格里菲思

&1944.艾弗里

肺炎双球菌转化实验基础理论的重大突破相关技术的飞速发展第5页/共113页第6页/共113页基因工程的诞生过程1967~1970196519771972~19831983~1988相关技术的飞速发展

DNA体外重组实现

重组DNA表达实验成功第一例转基因动物问世

1980.转基因小鼠1983.转基因烟草

基因转移载体的发现

1967.罗思

&海林斯基质粒

工具酶的发现

1970.阿尔伯,内森斯

&史密斯发现限制性核酸内切酶DNA合成和测序技术的发明

1965.桑格（E.Sanger）氨基酸序列分析

1977.DNA序列分析PCR技术的发明

穆里斯（K.Mullis）第7页/共113页第8页/共113页大鼠的生长激素基因及其调控区第9页/共113页1998年，加拿大的一个研究小组展示了一只能在荧光下变绿的小鼠。这种小鼠被做了遗传改造，携带了一个水母绿色荧光蛋白基因。荧光鼠已被用来研究胚的生长和细胞内蛋白的运动。第10页/共113页基因转移载体特点

裸露、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外的双链环状DNA；自我复制能力；可插入外源DNA片段；标记基因。质粒新霉素，四环素，卡那霉素….第11页/共113页注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。氨苄青霉素四环素第12页/共113页噬菌体载体酵母人工染色体动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）

第13页/共113页分布：限制性核酸内切酶主要在原核生物中特异性磷酸二酯键识别序列切割位点举例：切点：作用特点：第14页/共113页黏性末端黏性末端被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对限制性核酸内切酶磷酸二酯键第15页/共113页黏性末端和平末端第16页/共113页识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个)主要是原核生物。4000种。（1）来源：（2）种类：（3）作用：（4）结果：形成两种末端黏性末端平末端（小结）限制性核酸内切酶第17页/共113页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。HindⅢ属

系

株

序Haemophilus

influenzae

d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶命名第18页/共113页切割外源DNA，保护自身。含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。？限制酶在原核生物中的作用第19页/共113页要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端。是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。思考：第20页/共113页1、种类：2、作用部位：E.coliDNA连接酶（黏性末端）T4DNA连接酶（黏性末端和平末端）磷酸二酯键DNA连接酶都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。第21页/共113页第22页/共113页Bt毒蛋白基因第23页/共113页1、获取目的基因2、构建表达载体3、导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的步骤“分”“切”“接”“转”“筛”第24页/共113页1、目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成请阅读P9第一段一、目的基因的获取第25页/共113页将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库(一)从基因文库中获取目的基因第26页/共113页文库构建步骤第27页/共113页基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?第28页/共113页2.从基因文库中获取目的基因①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段重组DNA限制酶与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)（基因组文库）第29页/共113页②反转录法：供体细胞的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA2.从基因文库中获取目的基因（cDNA文库）重组DNA与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离第30页/共113页第31页/共113页③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成DNA合成仪2.从基因文库中获取目的基因第32页/共113页三种目的基因提取方法的优缺点仅限于合成核苷酸对较少的简单基因专一性

最强化学

合成法操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性强反转录法工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因操作简便广泛使用鸟枪法缺点优点2.从基因文库中获取目的基因第33页/共113页(二)利用PCR技术扩增目的基因“他是个很活跃的孩子，常把各种东西混到一起。3岁那年，他把鸡蛋打碎搅成油漆，然后将房子刷成了黄色。我经常发现他几瓶子几瓶子地收集昆虫和蛆。我想他简直疯了。他对一切都入迷。今天我才知道这是因为他的思维太活跃了。”K.Mullis(1944—)第34页/共113页5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

551.基本工作原理第35页/共113页Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第36页/共113页模板DNA

特异性引物耐热DNA聚合酶

dNTPs2.PCR体系基本组成成分第37页/共113页3.PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第38页/共113页第39页/共113页①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术；②原理：DNA复制；③条件：已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、一对引物、DNA聚合酶。④方式：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增4.小结第40页/共113页⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。4.小结第41页/共113页历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献—钱嘉韵1998年钱嘉韵在台湾国立政治大学讲座第42页/共113页质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种二、基因表达载体的构建--核心第43页/共113页基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。第44页/共113页转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。三、将目的基因导入受体细胞第45页/共113页1、导入植物细胞：农杆菌转化法土壤农杆菌冠瘿瘤，发状根第46页/共113页1、导入植物细胞：农杆菌转化法（1）农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上。（2）转化：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达。第47页/共113页（1）方法：显微注射法（2）程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物2、将目的基因导入动物细胞第48页/共113页3、将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子（1）原核生物特点：

繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：CaCl2法（3）常用菌：大肠杆菌第49页/共113页——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法：方法：方法：DNA-DNA分子杂交DNA-RNA分子杂交抗原-抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定第50页/共113页目的基因的检测示意图第51页/共113页放射自显影照片第52页/共113页基因操作的基本步骤第53页/共113页基因工程与医药卫生生产基因工程药品用于基因诊断与基因治疗基因工程与农牧业、食品工业培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种培育具有各种抗逆性的动植物新品种为人类开辟新的食物来源基因工程与环境保护用于环境监测用于被污染环境的净化基因工程的应用第54页/共113页基因工程与医药卫生抗生素的合理使用抗生素一般是指由细菌、霉菌或其它微生物在繁殖过程中产生的，能够杀灭或抑制其它微生物的一类物质及其衍生物，用于治疗敏感微生物（常为细菌或真菌）所致的感染。第55页/共113页抗生素史话1928年，弗莱明1940年，弗洛里、钱恩1941年，青霉素首度进行人体试验。1943年，青霉素得到量产与应用。1945年，三人获诺贝尔生理学奖。第56页/共113页1944年，瓦克斯曼（SelmanAbrahamWaksman,1888-1973）在灰色链霉菌中发现链霉素（streptomycin），由于链霉素是当时第一个能够有效治疗肺结核的药物，瓦克斯曼因而获得1952年的诺贝尔生理学奖。他的成功，再一次引起全世界科学家对利用微生物生产抗生素的研究热潮。抗生素史话第57页/共113页人们找到6000多种抗生素广泛应用的抗生素大约200种全世界每年抗生素产量超过1.0X108kg

产值约100亿美元抗生素史话第58页/共113页抗生素的分类分类方法抗生素种类举例根据抗生素的生物来源分类①放线菌产生的抗生素②真菌产生的抗生素③细菌产生的抗生素④植物或动物产生的抗生素①链霉素、四环素等②头孢霉素D③多黏菌素④大蒜素、鱼素等根据抗生素的作用分类①广谱抗生素②抗细菌抗生素③抗真菌抗生素④抗病毒抗生素⑤抗肿瘤抗生素①氨苄青霉素②青霉素、链霉素③制霉素④四环类抗生素⑤阿霉素第59页/共113页抗生素的作用机制第60页/共113页抗生素的不良反应副作用如恶心和呕吐毒性反应如肝、肾及其它器官损害后遗反应如链霉素引起永久性耳聋

过敏反应如青霉素引起过敏性休克药物相互作用引起不良反应二重感染（病菌抗药性产生）***第61页/共113页抗生素的不良反应第62页/共113页抗生素的不良反应第63页/共113页五、抗生素的不良反应第64页/共113页第65页/共113页合理使用抗生素严格掌握适应症发热原因不明者不宜采用抗生素病毒性疾病不宜采用抗生素

使用前做药敏试验新生儿、老年人、肝肾功能不全者慎用毒性大的抗生素严加控制预防性应用抗生素应尽量避免在皮肤、黏膜等局部使用抗生素，易导致过敏反应。第66页/共113页基因工程与医药卫生基因诊断与基因治疗第67页/共113页基因诊断基因基因诊断性状蛋白质生化诊断临床诊断第68页/共113页基因诊断制备基因探针提取目的基因PCR扩增获得单链DNA将目的基因转膜探针与尼龙膜杂交冲洗尼龙膜，检测第69页/共113页基因芯片（genechip），又称DNA微阵列（DNAmicroarray）或DNA芯片。是一块带有DNA微阵列涂层的特殊玻璃片，在数平方厘米的面积上安装数千或数万个核酸探针，经由一次测验，即可提供大量基因序列相关资讯。它是基因组学和遗传学研究的工具。研究人员应用基因芯片就可以在同一时间定量分析成千上万个基因表达的水平，具有快速、精确、低成本的生物分析检验能力。基因芯片第70页/共113页Twocolor-DNAmicroarray第71页/共113页第72页/共113页Canplace20,000genepiecesinasmallspaceatonetime第73页/共113页基因治疗1.基因治疗：

将特定外源基因导入有基因缺陷的细胞来治疗疾病。2.基因治疗过程：选择治疗基因治疗基因与载体结合治疗基因正常表达第74页/共113页体外基因治疗体内基因治疗9~11天第75页/共113页美国医学家W·F·安德森等人对腺苷脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。1990年9月14日，安德森对一例患重症联合免疫缺陷病的4岁女孩进行基因治疗。这个4岁女孩先天ADA缺乏，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上正常人的生活，并进入普通小学上学。第76页/共113页基因治疗对癌症的治疗方案抑制癌细胞增殖基因导入癌细胞抑制癌细胞转录DNA片断导入癌细胞提高机体免疫力基因导入免疫系统阻断癌细胞繁殖提高免疫力第77页/共113页人体的器官移植定义：将某一个体的器官移植到自体或另一个体体内的手术方法。器官移植的历史：

幻想阶段：

实验研究阶段：19世纪～20世纪初进入临床阶段

临床发展阶段公元前200年左右，扁鹊曾给两位病人进行了心脏移植？第78页/共113页罗纳德·赫里克和理查德·赫里克进入临床阶段第79页/共113页1963年，美国的医学家进行人类历史上的第一例肝移植1963年，美国另一位医生做了第一例肺移植1967年，南非完成了第一例心脏移植（存活18天）1968年，美国几位科学家又进行了第一例心肺联合移植截止到2003年底全球器官移植已突破百万例，包括肾、肝、心、肺、骨髓、小肠、关节、甲状旁腺、胰腺等33种器官或组织。目前我国每年约有6000例肾移植手术,累计已达86800例。临床发展阶段第80页/共113页2004年9月17日上午1点至晚上11点，湖北省华中科技大学同济医院陈知水教授主刀切除了陈某肝、胆、脾、胰腺等上腹部七大组织器官，并彻底清扫腹膜后淋巴结，然后将供体的肝脏、胰腺、十二指肠原位移植入患者腹腔。多器官移植技术是器官移植领域最为复杂的尖端技术，全球仅有近60例手术报告，且手术绝大部分由美国和法国世界著名大型器官移植中心进行，在亚洲等其他地区十分罕见。该手术在中国仅有三例，第一例由同济医院于1994年实施，但患者术后一周左右即死亡。第二例由广州中山大学附属第一医院于2004年5月实施，成为亚洲首例成功的多器官移植病例。本次手术为第三例，其手术难度较第二例更大，标志着我国多器官移植技术水平提高到一个新阶段。临床发展阶段第81页/共113页第82页/共113页器官移植——肾移植血液透析第83页/共113页器官移植——角膜移植

角膜是覆盖在有色的虹膜和瞳孔上的透明层第84页/共113页器官移植——角膜移植移植适应症严重角膜感染、外伤、损害、或瘢痕形成

光线不能通过角膜；以及感染和角膜的遗传性疾病第85页/共113页器官移植——角膜移植角膜移植术在局麻下进行，患者意识清醒，但是丧失痛觉。沿角膜外缘做切口第86页/共113页器官移植——角膜移植切除损伤的角膜后，将要移植的角膜缝到适当位置。移植角膜取自脑已经死亡、仅靠仪器维持生命的捐赠人第87页/共113页器官移植——角膜移植移植角膜的存活时间长，术后视力改善明显第88页/共113页器官移植的所要解决的主要问题血管吻合技术（手术技巧）器官供体来源问题排异反应（本质上是免疫反应）为什么同卵双生间器官移植容易成功？ABO血型抗原适合HLA抗原系统一半以上相同免疫抑制剂（尤其是环孢霉素A的诞生）免疫抑制剂可能带来什么问题？（平衡？）第89页/共113页人造器官美第一颗人造心脏获批使用，价格10万美元,手术中医生将把它和上心房缝接起来。辛卡迪亚人造心脏只能在医院里使用，患者被植入人造心脏后不能离开医院，因为接受人造心脏的患者必须同电脑控制台保持连接，以便调节血液流量，将病人的血压恢复到正常值，并且支持一些生命器官，如肾和肝。对81位患者的临床试验中，79％的人在人造心脏的支持下完全能活到接受心脏移植手术时，平均维持了79天，最长的甚至在心脏移植手术前活了400天。

第90页/共113页1995年，Massachusetts的研究者们在一个可生物降解的人耳形状的模子表面接种上人软骨组织细胞，然后将模子移植到裸鼠身上（裸鼠因为存在天然的免疫系统缺陷，而不会对模子产生免疫排斥反应）。人软骨组织细胞从小鼠的血液中得到营养，不断生长并填满模子，最终造出了一个“耳朵”。人耳鼠第91页/共113页胚胎干细胞成体干细胞干细胞第92页/共113页一、植物基因工程硕果累累转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.基因工程与农牧业、食品工业第93页/共113页1.抗虫转基因植物基因工程与农牧业、食品工业第94页/共113页2.抗病转基因植物基因工程与农牧业、食品工业第95页/共113页3.其他抗逆转基因植物基因工程与农牧业、食品工业第96页/共113页4.利用转基因改良植物的品质基因工程与农牧业、食品工业第97页/共113页基因工程与农牧业、食品工业第98页/共113页繁殖具有抗病能力、高产仔率、高产奶率和高质量的皮毛等优良品质的转基因动物。该过程的重要步骤是通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中。基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？第99页/共113页二、动物基因工程前景广阔1.用于提高动物生长速度基因工程与农牧业、食品工业转生长激素基因鲤鱼（左）第100页/共113页2.用于改善畜产品的品质3.用转基因的动物生产药物乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)基因工程与农牧业、食品工业第101页/共113页1、环境监测基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。2、环境污染治理基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。基因工程与环境保护第102页/共113页1、有