第九章紫外可见分光光度法

1第一页，共四十九页，2022年，8月28日◆学习目的通过学习光谱分析法概论、紫外-可见分光光度法的基本原理、分光光度计的基本构造、降低测量误差的方法、常用的定性、定量方法等知识，了解光学分析法的知识体系，熟悉紫外-可见分光光度法的实际应用，会用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并对有关物质进行定性定量分析，为学习红外分光光度法、荧光分光光度法、核磁共振波谱法及药物分析课中有关药品的定性鉴别、杂质检查和含量测定方法奠定基础。

第二页，共四十九页，2022年，8月28日◆知识要求1．掌握朗伯-比尔定律概念、表示及条件，吸光系数和吸收光谱的意义、表示，常用的定量分析方法原理和应用。2．熟悉紫外-可见吸收光谱的产生机制、分光光度计的基本结构、偏离朗伯-比尔定律的主要因素。3．了解光谱分析法的分类、测量条件的选择、定性分析的依据和方法。第三页，共四十九页，2022年，8月28日◆能力要求1.能够用朗伯-比尔定律解决定量计算问题

。2.能够绘制吸收光谱曲线，找出被测物质的最大吸收波长。3.能够制备标准曲线，并能应用标准曲线对样品进行定量分析。4.会使用常见的紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度。

第四页，共四十九页，2022年，8月28日第一节光谱分析法概论

第一节光谱分析法概论

一、电磁辐射与电磁波谱

电磁辐射：电磁辐射，也叫电磁波，具有波粒二象性。

c＝λυ

E＝hυ电磁波谱：把电磁辐射按照波长大小顺序排列起来，就称为电磁波谱。紫外光区和可见光区仅是电磁波谱中的一小部分。

第五页，共四十九页，2022年，8月28日

表9-1电磁波谱分区表电磁辐射区段波长范围能级跃迁的类型射线10-3~0.1nm原子核能级X射线0.1~10nm内层电子能级远紫外辐射10~200nm内层电子能级紫外辐射200~400nm价电子或成键电子能级可见光区400~760nm价电子或成键电子能级近红外辐射0.76~2.5μm涉及氢原子的振动能级中红外辐射2.5~50μm原子或分子的振动能级远红外辐射50~500μm分子的转动能级微波区0.3mm~1m分子的转动能级无线电波区1~1000m磁场诱导核自旋能级第一节光谱分析法概论

第六页，共四十九页，2022年，8月28日第一节光谱分析法概论二、光谱分析法的分类发射光谱法：物质的原子、分子或离子在一定条件下，由低能态（基态）跃迁至高能态（激发态），再由高能态跃迁至低能态，同时产生电磁辐射，根据这种光谱而建立的分析方法称为发射光谱法。吸收光谱法：利用物质对电磁辐射的选择性吸收而建立的分析方法称为吸收光谱法。紫外-可见分光光度法是其中重要的一种方法。

第七页，共四十九页，2022年，8月28日第一节光谱分析法概论三、紫外-可见分光光度的特点1.灵敏度高2.准确度高3.精密度好4.选择性好5.仪器设备简单，价格低廉，易于普及；操作简便，测定快速6.应用范围广泛第八页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法第二节紫外-可见分光光度法一、紫外-可见吸收光谱的产生当分子（或离子）受到光照射时，能够吸收具有一定能量的光量子，由能量较低的基态能级E1跃迁到能量较高的激发态能级E2

，即物质对光具有选择性吸收。紫外-可见光的能量(h)与分子（或离子）发生电子能级跃迁前后的能量差（E2-E1）恰好相等，电磁辐射与被测物发生能量交换，产生紫外-可见吸收光谱。第九页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动1．紫外-可见光的波长范围是A．200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列叙述错误的是A．光的能量与其波长成反比B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈C．物质对光的吸收有选择性D．光的能量与其频率成反比第二节紫外-可见分光光度法第十页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动3．紫外-可见分光光度法属于A．原子发射光谱法B．原子吸收光谱法C．分子发射光谱法D．分子吸收光谱法4．分子吸收可见-紫外光后，可发生哪种类型的分子能级跃迁A．转动能级跃迁B．振动能级跃迁C．电子能级跃迁D．以上都能发生

第二节紫外-可见分光光度法第十一页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法二、透光率与吸光度I0＝Ia+It+Ir

I0＝Ia+It

透射光强度It与入射光强度I0的比值称为透光率或透光度T。第十二页，共四十九页，2022年，8月28日对透光率的倒数取对数，称为吸光度即：第二节紫外-可见分光光度法第十三页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法三、朗伯-比尔定律

当一束平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及液层厚度L的乘积成正比，即

A＝K·L

·c。朗伯-比尔定律是定量分析的理论依据。第十四页，共四十九页，2022年，8月28日朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，而且也适用于紫外光和红外光；不仅适用于均匀、无散射的溶液，而且也适用于均匀、无散射的固体和气体。实验证明：溶液对光的吸光度具有加和性。如果溶液中同时存在两种或两种以上的吸光性物质，则测得的该溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物质吸光度的总和，即： A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac

第二节紫外-可见分光光度法第十五页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动您能说出朗伯-比尔定律的意义及应用条件吗？第二节紫外-可见分光光度法第十六页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法四、吸光系数摩尔吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时所测得的吸光度称为摩尔吸光系数，常用ε表示。百分吸光系数：在入射光波长一定时，溶液浓度为1﹪（W/V）、层厚度为1cm时所测得的吸光度称为百分吸光系数，常用表示。

二者的关系：

第十七页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动用双硫腙测定Cd2+溶液的吸光度A时，Cd2+（Cd的原子量为112）的浓度为140μg/L，在λ＝525nm波长处，用L＝1cm的吸收池，测得吸光度A＝0.220，试计算摩尔吸光系数和百分吸收系数，实验中应选用哪种材质的吸收池盛装溶液？

第二节紫外-可见分光光度法第十八页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法五、吸收光谱曲线概念：以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标所描绘的曲线，称为吸收光谱曲线，简称吸收光谱。特点:（1）在相同条件下，同一物质的不同浓度的溶液，其吸收光谱曲线相似，且λmax相同。这是定性分析的基础。（2）测定条件一定时，吸光性物质的浓度越大，其吸光度也越大。这是定量分析的基础。第十九页，共四十九页，2022年，8月28日吸收光谱曲线的特征参数第二节紫外-可见分光光度法λsh第二十页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动某有色溶液的摩尔浓度为c，在一定条件下用1cm比色杯测得吸光度为A，则摩尔吸光系数为A．cAB．cMC．A/CD．C/A第二节紫外-可见分光光度法第二十一页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法六、偏离朗伯-比尔定律的因素化学因素:(1)溶液的浓度(2)物质的化学变化(3)溶剂的影响光学因素:(1)非单色光(2)杂散光(3)非平行光(4)反射现象(5)散射现象第二十二页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法第二十三页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法七、紫外-可见分光光度计基本结构：

光源—单色器—吸收池—检测器—显示器基本类型:(1)可见分光光度计

(2)紫外-可见分光光度计1）单波长分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计2）双波长分光光度计

第二十四页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法第二十五页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法第二十六页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动试述紫外-可见分光光度计的主要部件及其作用？

第二节紫外-可见分光光度法第二十七页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择(Ⅰ)测量误差:(1)仪器误差(2)操作误差

仪器测量条件的选择：(1)选择最大吸收波长作为入射光。(2)吸光度读数范围应控制在吸光度为0.2~0.7、透光率为20%~65%之间。

第二十八页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法八、测量误差与分析条件的选择（Ⅱ）显色反应条件的选择：

(1)对显色剂及显色反应的要求

(2)控制合适的显色反应条件

参比溶液的选择：

(1)溶剂参比溶液(2)试样参比溶液

(3)试剂参比溶液(4)平行操作参比溶液第二十九页，共四十九页，2022年，8月28日课堂互动测定试样时，吸光度的读数应控制在0.2～0.7范围内。若吸光度读数不在此范围，可采用哪些方法进行调整?第二节紫外-可见分光光度法第三十页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法九、定性与定量分析方法（一）定性分析定性分析依据:

最大吸收波长、吸光系数和吸收光谱曲线的形状。定性分析方法:(1)比较光谱的一致性

(2)比较吸收光谱的特征数据及比值的一致性纯度检查：将药品光谱与药品标准光谱相对照，利用杂质的特征吸收，可以检测出微量杂质。第三十一页，共四十九页，2022年，8月28日实例分析中国药典(2005年版)规定：贝诺酯加无水乙醇制成每1ml约含7.5的溶液，在240nm处有最大吸收，相应的百分吸光系数()应为730～760。维生素B12也有三个吸收峰，分别在278nm、361nm、550nm波长处，它们的吸光度比值应为：A361nm/A278nm在1.70～1.88之间，A361nm/A550nm在3.15～3.45之间。

第二节紫外-可见分光光度法第三十二页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法（二）定量分析定量分析依据:A＝K

·c

定量分析方法：1.单组分溶液的定量方法(1)标准曲线法(2)标准溶液对比法(3)吸光系数法2.二元组分溶液的定量方法

(1)解联立方程组法

(2)等吸收波长消去法

(3)差示分光光度法

第三十三页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法标准曲线法:标准曲线法是紫外-可见分光光度法中最经典的定量方法。具体测定的方法和步骤如下：①配制一系列不同浓度的标准溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下，以待测组分的最大吸收波长作为入射光，分别测定各标准溶液对应的吸光度。②以浓度c为横坐标、吸光度A为纵坐标描绘曲线，称为标准曲线，也叫工作曲线。③按照相同的实验条件和操作程序，用待测溶液配制未知试样溶液并测定其吸光度A样，在标准曲线上找到与之对应的未知试样溶液的浓度c样。第三十四页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法第三十五页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法标准对比法:在相同的条件下，配制浓度为cs的标准溶液和浓度为cx的试样溶液，在最大吸收波长处，分别测定二者的吸光度值为As、Ax

，依据朗伯-比尔定律得：As=csLAx=cxL

则:第三十六页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法吸光系数法:吸光系数法又称绝对法，是直接利用朗伯-比尔定律的数学表达式A＝KcL进行计算的定量分析方法。在手册中查出待测物质在最大吸收波长处的吸光系数或,并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A，则其浓度为：

或第三十七页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法有时也可以将待测样品溶液的吸光度换算成样品组分的吸光系数，计算与标准品的吸光系数的比值，求出样品中待测组分的质量分数。或第三十八页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法例如：维生素B12水溶液在=361nm处的百分吸光系数=207。取维生素B12样品30.0mg，加纯化水溶解，用1L的容量瓶定容。将溶液盛于1cm的吸收池，测得361nm波长处的吸光度A=0.600，试求样品中维生素B12的质量分数。解：第三十九页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法二元组分溶液的定量方法（1）解联立方程组法

当试样溶液中各待测组分相互干扰不太严重时，可根据吸光度具有加和性的特点，在同一试样溶液中同时测定两个或两个以上的待测组分。假设要测定试样中有两个待测组分a和b，如果分别绘制a、b两个纯物质的吸收光谱，则有三种情况。

第四十页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法第四十一页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法（Ⅰ）表明，两个待测组分在各自的最大吸收波长处，另一组分没有吸收，可以用测定单组分的方法，分别在λ1波长处测定组分a的吸收度,在λ2波长处测定组分b的吸收度，再由偏离朗伯-比尔定律求得ca、cb。测定时互不干扰。

（Ⅱ）表明，在待测组分a的最大吸收波长λ1处，待测组分b无吸收，即组分b对组分a的测定无干扰，而在待测组分b的最大吸收波长λ2处，组分a有吸收，即组分a对组分b的测定有干扰。这时，可以在波长λ1处用测定单组分的方法，单独测量组分a；然后在波长λ2处测量溶液的总吸光度及a、b纯物质的吸收系数和，根据吸光度的加和性，从而可以求出cb。

第四十二页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法（Ⅲ）表明，两个待测组分彼此相互干扰，此时，在波长λ1和λ2处分别测定试样溶液的总吸光度及，同时测定a、b纯物质的吸光系数、和、，根据吸光度的加和性，则由联立方程组求得ca、cb。

第四十三页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光度法（2）等吸收波长消去法（双波长分光光度法）当试样中两个待测组分的相互干扰比较严重时，用解联立方程组的方法进行定量分析会产生较大的误差，这时可以用等吸收波长消去法进行测定。在试样中含有两个待测组分a和b时，若要测定组分b，组分a有干扰，应设法消除组分a的吸收干扰。首先选择待测组分b的最大吸收波长λ2作为测量波长，然后用作图的方法选择参比波长λ1，使组分a在这两个波长处的吸光度相等。

第四十四页，共四十九页，2022年，8月28日第二节紫外-可见分光光