实验六细胞核的分离与核酸的鉴定

实验六细胞核的分离与核酸的鉴定第1页/共27页实验6细胞核的分离与核酸的鉴定（Separationofcellnucleiandidentificationofnucleicacids）第2页/共27页

1.掌握离心技术的原理及离心机的使用；2.熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法；3.熟悉鉴定核酸的方法；

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一、分离细胞质与细胞核

１.破碎细胞细胞破碎的方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法第4页/共27页第5页/共27页

利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。２.离心技术

细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。第6页/共27页离心方法差速沉降离心法

速率区带离心法等密度区带离心法密度梯度区带离心法

√√第7页/共27页差速沉降离心法(differentialcentrifugation)

采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。

加速

低速高速第8页/共27页

差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。

缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。

第9页/共27页每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为：

V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。V：是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）；d：样品颗粒的直径（厘米）；σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）；s：介质溶液的密度（克/厘米3）；η：介质溶液的粘性系数（克/厘米·秒）；ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分；

r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）；密度梯度离心法的理论依据第10页/共27页待分样品的沉浮行为如何确定？当σ>S时V>0即样品顺离心力方向沉降

σ<S时V<0即样品逆离心力方向上浮

σ=S时V=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置

用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。第11页/共27页速率区带离心法

人为地加入不同密度的活性物质，形成一个较为平缓的介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

此法用于分离具有一定沉降速度差的颗粒（沉降速度差为20%或更少）或分子量相差3倍的蛋白质。适用于分离密度相似而大小有别的样品。第12页/共27页

样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。

等密度区带离心法此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。第13页/共27页优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。

b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降 系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。

c.颗粒不会挤压变形。缺点：a.离心时间较长；

b.需要制备梯度；操作严格，不易掌握。

密度梯度区带离心法(densitygradientcentrifugation)第14页/共27页

1、核酸的种类及其分布请思考？

DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)

核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。二、核酸的鉴定第15页/共27页

2、核酸的水解核酸

核苷酸

磷酸

碱基

戊糖

定糖法（戊糖的差异）第16页/共27页（1）核糖核酸的鉴定浓HCl＋3H2O+

β－

D－核糖

糠醛

糠醛

3，5－二羟基甲苯

绿色化合物

RNA

ＯＨˉ

水解

β－

D－核糖

第17页/共27页（2）脱氧核糖核酸的鉴定DNAＨ＋

水解

β－D－２－脱氧核糖-H2O硫酸脱氧核糖

ω－羟基－γ－酮基戊醛蓝色化合物第18页/共27页（1）分离细胞质与细胞核（1）分离细胞质与细胞核（2）核酸的鉴定第19页/共27页0.5g肝组织＋少许石英砂研磨加5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤

肝匀浆，倾入离心管离心：3000r/min；10′上层液沉淀加入1ml0.25mol/L蔗糖柠檬酸溶液

核悬液沿壁缓铺于8ml

0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：2000r/min；5′上层液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，5′上层液（弃去）沉淀初步纯化的细胞核

5ml0.02mol/LNaOH溶解细胞核待测样品鉴定

实验流程图第20页/共27页

编号12细胞质（滴）20-核液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:

编号123细胞质水解液（滴）20--核液水解液（滴）-20-5％三氯醋酸（滴）1010303,5一二羟基甲苯液（滴）3030301.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：（2）核糖核酸的鉴定混合各管沸水浴(10′)冷却加入5%三氯醋酸(8ml)搅匀后离心

2000r/min；5′上清液

立即混合各管沸水浴(10′)冷却比较各管颜色

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2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：编号12细胞质（滴）20-核液（滴）-201mol/L过氯酸(滴）2020

编号123细胞质水解液（滴）20--核水解液（滴）-20-1mol/L过氯酸（滴）20二苯胺试剂（滴）202020（3）脱氧核糖核酸的鉴定混合各管冷却离心

上清液

立即混合各管冷却比较各管颜色

2000r/min;5′第22页/共27页表1.核糖核酸的鉴定试管编号123现象试管编号123现象表2.脱氧核糖核酸的鉴定第23页/共27页1．规范操作，防止滴管、试剂的污染。细核悬液的平铺要轻柔；浓酸的取用要小心；使用离心机注意平衡，转速从低到高；第24页/共27页思考1.本实验结束后若想继续测定肝脏中DNA、RNA的含量，可用什么方法？2.我们已经学习了电泳法和层析法来分离蛋白质，请