食品化学实验报告

Folin-酚法测定蛋白质含量

一、目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深一、目的

掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。

二、原理

Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）

2．仪器

（1）722型（或721型）分光光度计

（2）4000r/min的离心机

（3）分析天平

（4）容量瓶（50mL）

（5）量筒

（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）

3．试剂（纯度均为分析纯）

（1）0.5mol/LNaOH

(2)试剂甲：

（A）称取10gNa2CO3，2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。

（B）称取0.5gCuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。

（3）试剂乙：

在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL蒸馏水，再加50mL85％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。

四、操作步骤

1．标准曲线的制作

（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。

（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用722型分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。

（1）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。

2．样品的提取及测定

（1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用6mL蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管，离心4000r/min、20min。将上清液转入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。

（2）取普通试管2支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定光密度，并记录结果。

五、结果计算

计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。

六、附注

（1）进行测定时，加Folin试剂要特别小心，因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

（2）本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。

七、思考题

1．含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应？

2．测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显色法以外，还可以用什么方法？

参考答案

1．含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能与Folin-酚试剂反应呈蓝色，因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钼兰和钨兰混合物）。磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。3、在各试管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min(准确计时)后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、奖试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）:称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5）；③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④5%三氯醋酸（TCA）溶液。四、计算1、在规定的实验条件下，以每分钟增加0.001吸光度定义为一个酶单位。2、每克酶制剂中没活力的计算：∆A×1000/(t×w)酶活力单位/克酶制剂式中，∆A——样品与空白吸光度差值（即A1和B1的吸光值）；t——酶作用时间（本实验为10min）;w——反应中酶的用量，g五、说明1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH范围表现出活力，但是在接近中性条件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45℃以下可保持较长时间的稳定性。六、数据记录与处理A1=0.279B1=0.573酶含量为0.001g/ml酶活力1=∆A×1000/(t×w)=0.279×1000/10/0.001/0.20=1.395×105酶活力单位/克酶制剂酶活力2=∆A×1000/(t×w)=0.573×1000/10/0.001/0.40=1.4325×105酶活力单位/克酶制剂平均值=（1.395×105+1.4325×105）=141375酶活力单位/克酶制剂平均相对相差=（143250-139500）/141375×100%=2.65%七、思考题1、蛋白酶有哪几类？答：①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。②按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶③微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶④按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的碱性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶2、影响酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化学反应的速率来表示的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，酶活力的测定也就是测定酶促反应的速率。①酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。②底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随地物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不会增加。③温度对酶活力的影响：在适宜的温度范围内，酶促反应速度随温度升高而增加，超过最适反应温度，酶活力将会下降。④PH对酶活力的影响：酶在最适PH范围内表现出活性，大于或小于最适PH，都会降低酶活性。⑤激活剂对酶活力的影响：某些无机阳离子、阴离子、有机化合物可作为激活剂，能够激活酶，使其表现出催化活性或强化其催化活性。⑥抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制剂能够减弱、抑制甚至破坏