大肠杆菌内毒素损伤小鼠肺的病理学研究以及药物干预作用

大肠杆菌内毒素损伤小鼠肺的病理学研究以及药物干预作用摘要

为研究大肠杆菌内毒素对器官组织的损伤作用和药物的干预作用，采用注射内毒素给小鼠与家兔造模和自拟中药、西药、中西药三种复方药物干预试验，采样、切片，HE染色，显微镜检等病理切片技术的方法进行研究。结果表明内毒素对小鼠和家兔组织器官都有不同程度的损伤，中西药复方药物对内毒素引起动物脏器损伤有较好的干预作用。关键词

大肠杆菌内毒素药物干预作用病理切片100多年前，RichardHeitter在研究霍乱弧菌的发病机理时，发现了内毒素。50年后，世界各国的科学家陆续揭开了内毒素的神秘面纱：内毒素（endotoxin）特指革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）成分,细菌在死后破裂或用人工方法裂解菌体后释放[1]。内毒素具有多种毒性反应，如致热性、白细胞增多（小剂量）或减少（大剂量）、血糖增高以及对小白鼠的致死亡作用等[2]。20世纪青霉素的诞生及大量抗生素的广泛使用，确实解除了很多的疾病，为人类的健康做出了不可抹灭的贡献。但抗生素无节制、不正确的使用也给人们带来了新的疾病—内毒素疾病。专家报告内毒素已成为威胁人类健康的头号杀手，内毒素疾病已成为人类重要的致死性疾病之一[3]。目前，内毒素的研究达到了分子水平，其结构、致病机理已逐步揭晓，但内毒素对动物脏器的损害程度及药物治疗后的恢复等方面的研究报道甚少。且清热解毒中药在抗菌方面有较好的效果[4，5，6]，但其对大肠杆菌内毒素所引起的发热损伤影响尚少见报道，为此，我们自拟中药、西药、中西药三种复方药进行研究，利用解剖、病理、药理等实验技术，对大肠杆菌内毒素引起的动物脏器损伤及药物治疗后的逆转情况进行探索，以期为内毒素致病机理研究和临床疾病防治提供理论依据。1

材料与方法1.1实验药品、器材及动物1.1.1药品与试剂：中药针剂：由黄苓、黄柏、栀子、连翘组成，原料购于重庆市荣昌县石家药房，参照文献[7]制成针剂,每毫升含生药1克,装瓶,灭菌,备用。西药针剂：由安乃近粉剂、环丙沙星粉剂组成，原料购于重庆市科信动物药品厂，参照文献[7]制成针剂。中西药复方制剂：由黄苓、黄柏、栀子、连翘和安乃近粉剂、环丙沙星粉剂组成，参照文献[7]制成针剂。试剂：蛋白胨上海东海制药厂琼脂条福建石狮市琼脂副食品加工厂牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司乙醇重庆川东化工（集团）有限公司苯酚重庆北碚化学试剂厂盐酸国营重庆无机化学试剂厂甲醛重庆东方华工有限公司氢氧化钠重庆川东化工（集团）有限公司戊二醛武汉有机合成化工厂无水氯化钙重庆矿物局“五七”化钙厂均为化学纯或分析纯。1.1.2器材：显微照相机OlympusB×41Japan培养箱PYX-DGS-40×50.上海市跃进医疗器械厂离心机TDL-5.上海安婷科学仪器厂切片机浙江金华无线电厂显微镜821969.olympn.Japan电热恒温水温箱S648.上海医疗器械厂高压灭菌锅、试管、培养皿、胶头滴管、透析带、离心管、玻片、烧杯等实验室常规器材。1.1.3实验动物小白鼠，昆明种，健康无病，体重20±2g，雌雄均可，由西南农业大学荣昌校区实验动物科提供。家兔，健康无病，体重1.5～2.0kg，雌雄均可，由西南农业大学荣昌校区实验动物科提供。1.2实验方法1.2.1大肠杆菌内毒素的制备[8]将鸭大肠杆菌→接种平皿，培养48h→用无菌生理盐水洗下菌苔→得菌液→离心(3000r/m)→取菌泥（计算重量）40g加无菌水360mL→加入已预热的90％酚液360mL，68℃水浴，搅动30min→冷却至4℃→形成酚水两相→吸取水相→离心（6000r/m）→取水相→透析48h（去酚）→得粗制内毒素。1.2.2实验方法与指标1.2.2.1内毒素对小白鼠组织结构的影响：将68只小白鼠称重、编号，分成５组(正常组，模型组，中药组，西药组，中西药组)，除正常组，模型组外，其余三组分别注射中药针剂、西药针剂、中西药复方针剂，3天后，除正常组外，其余各组均注射内毒素0.13mL/20g,然后再连续注射药物3天后,采心、肝、脾、肺、肾、血管等组织，经固定、切片、染色、显微镜检、照相等步骤之后分析比较结果。1.2.2.2内毒素对兔子组织结构的影响：将20只兔子称重，编号，分成5组（正常组、模型组、中药组、西药组、中西药组），注射内毒素0.1mL/kg，观察临床症状（出现发热症状），然后连续注射药物（中药：0.5mL/kg；西药：1.5mL/kg；中西药：1.5mL/kg）3天后，剖检采样（肺），制切片。1.2.3切片制作[9.10]将样本固定24小时→流水冲洗24小时→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→染色→封片，读片，镜检，分析。2结果2.1临床表现

鼠：食欲减退，精神沉郁，发热，腹泻，可视黏膜发绀，眼内有脓性分泌物，呼吸急促，直至死亡。剖检可见皮下充血，肝有白色坏死点，肠壁变薄水肿，心脏表面有出血点。2.2.1内毒素对鼠的损伤作用

内毒素对鼠肺的损伤作用最明显（引起小鼠间质性肺炎、肺淤血和肺气肿，有大量的炎性细胞浸润）。2.2.1.1肺脏变化

由图可见，通过正常组与模型组的比较可见内毒素对鼠肺脏具有明显的损害作用。药物组与模型组比较可见中药组的病症稍轻微，对内毒素引起的小鼠肺脏损伤有一定的干预作用，西药组和中西药组作用不明显。图1.1.1肺脏（鼠正常组）图1.1.2肺脏（鼠模型组）H.E10×40H.E10×40图1.1.3肺脏（鼠中药组）图1.1.4肺脏（鼠西药组）H.E10×40H.E10×40鼠正常组肺泡为半球形或多面形薄壁囊泡，开口于肺

泡囊，肺泡管或呼吸性细支气管。肺泡壁极薄由肺泡上皮和基膜组成。相邻肺泡之间的结构为肺泡隔，由少量结缔组织及丰富的毛细血管网组成。(图1.1.1)

鼠模型组肺气肿—肺泡高度扩张，肺泡壁菲薄、破裂或消失，相邻肺泡融合成较大的囊腔（图1.1.2）

鼠中药组肺淤血（图1.1.3）

鼠西药组间质性肺炎—肺小叶间和肺泡壁的结缔组

织增生，炎性细胞浸润（图1.1.4）

鼠中西药组肺出血坏死（图1.1.5）图1.1.5肺脏（鼠中西药组）H.E10×403分析与讨论3.1

LPS是革兰氏阳性细菌感染致败血症休克的主要因素。内毒素（endotoxin）是指革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的脂多糖（1ipopolysaccharide,LPS）成分。细菌快速生长过程或死亡后均可产生内毒素。通常机体内部肠道中可存在大量的内毒素，但在正常情况下并不产生损害，只有当细菌产生的内毒素进入血流才能引起疾病。LPS由O特异性多糖、非特异性核心多糖和类脂A三部分组成。O特异性多糖是LPS最易发生变化的部分。非特异性核心多糖部分相对较稳定，其中内核部分的庚糖和2-酮基-3脱氧辛酸两种特异性糖分子在LPS分子中起着连接多糖和类脂A的作用。类脂A由2个葡萄糖胺、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成，是LPS最稳定的结构。类脂A和2-酮基-3脱氧辛酸是LPS的毒性部位。LPS是革兰氏阴性细菌感染致败血症休克的主要因素。内毒素血症的发生，可能有三种途径，即通过门静脉、直接跨壁吸收和通过肠淋巴管至血流。作为重要的致病因子，内毒素导致机体中毒，可出现一系列临床症状，表现为机体发热、休克、恶质病、死亡等。病理解剖可见广泛的组织、器官出血，弥漫性血管内凝血，并伴有组织器官水肿等。多种炎性细胞因子如IL-1、TNI-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-ﻻ及NO、O2-等分子是上述病理结果的主用介导者[13]。革兰氏阴性细菌的LPS是激活补体旁路活化途径的主要成分之一，在无抗体参与时，经旁路途径激活补体。补体活化后，一方面生成C3b，能调理细菌，促进吞噬细胞的吞噬。另一方面产生膜攻击复合体溶解细菌。补体的其他裂解产物如C3a、c5a又是很强的趋化因子和过敏毒素，诱发巨噬细胞和其他细胞如血管内皮细胞产生细胞因子包括TNF-2、IL-1、IL-6、IL-8、IL-18等。TNF-2、IL-1、IL-6均为内源性致热源，可作用于体温调节中枢，引起发热；TNF-2、IL-1等可刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎性介质（如NO、氧自由基等），它们协同作用，改变凝血功能，导致组织损伤和弥漫性血管内凝血，从而在感染性休克中起重要作用。IL-8由单核/巨噬细胞产生，对中性粒细胞有很强的趋化作用，并使之激活，它还可趋化T细胞和嗜碱性粒细胞。IL-18在内皮细胞无固定表达，只有刺激性表达。刺激剂有IL-1、TNE-2、LPS。IL-18可诱导Th1细胞产生细胞因子，同时它在炎症性肝损伤过程中也起着重要作用。本实验研究表明，内毒素能损伤动物体内大部分组织细胞[13]。3.2内毒素作用于细胞及药物的作用的机制推测为:3.2.1

内毒素作用于细胞的机制[14],研究结果不尽相同.有人认为内毒素主要作用于核染色体,对细胞器的作用是非选择性的；有人认为内毒素定位于线粒体；也有人认为主要是细胞膜系统受累，以破坏溶酶体为主。Lucas等发现，内毒素能在细胞核，尤其是核内染色质、核仁、核膜上特定性定位、能抑制核仁RNA转运到胞浆的核糖体上，RNA转运障碍可能导致酶蛋白合成减少，使胞质内各种酶活性降低。当内毒素增加时，高尔基体减少，并影响其分泌，线粒体膜形状改变，选择性的抑制电子转运系统。最肯定的是内毒素能消弱和破坏溶酶体膜，使之释放水解酶（酸性磷酸酶），可使细胞发生自体消化。由于内毒素是一种脂质大分子物质，对各种膜性结构均具有亲和力，故内毒素对细胞器的毒性作用是非选择性的。也有人认为内毒素主要定位于线粒体，使线粒体膜的完整性受到破坏，线粒体酶外逸活性下降，糖的有氧氧化供能途径受阻，细胞只能依靠无氧酵解代谢供能，出现线粒体肿胀、呼吸功能失调的供能不足，继而出现一系列的细胞变性，使细胞活力受影响。3.2.2药物作用的可能机制如下所述：3.2.2.1中药复方中黄芩、黄柏、栀子、连翘都是清热药［１５］，汪承柏［１６］认为清热解毒中药可以保护线粒体结构及活力，防止内毒素所致的过氧化物损伤。黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，含黄芩甙、黄芩素、汉黄芩素和黄芩新素等多种成分［１５］周晓红等［１７］观察了黄芩甙对醋酸铅致大鼠注入内毒素的主要成分LPS后血压，肺动脉压，血液有形成分、主要脏器病理形态及存活施加影响，结果显示，黄芩甙可使内毒素休克大鼠的血压明显回升，减轻血液浓缩和血小板、白细胞增多等血液有形成分的变化及主要脏器的损伤，延长存活时间。表明黄芩甙有逆转内毒素休克的作用并保护机体［１８］；赵红艳等［１９］认为黄芩甙可通过抑制下丘脑中PGE２和cAMP含量的升高而发挥其解热作用。黄柏为芸香科植物黄檗或黄皮树的干燥树皮，含小檗碱、黄柏碱、棕榈碱及黏液质等。有保护血小板、降低血糖、利胆、利尿扩张血管、降血压、退热抑菌等作用［１５］。栀子为茜草科植物栀子的干燥成熟果实，含栀子素（黄酮类）、果酸、鞣酸，藏红花酸等，可抑制体温中枢而有解热作用［１５］。有黄连、黄柏、黄芩、栀子组成的中药复方能破坏、降解内毒素，其抗炎作用与抑制IL-1，NO，PGE２等炎症因子生成有关［２０］。连翘为木犀科植物连翘的干燥成熟果实，含连翘酚、齐墩果酸、皂甙、维生素Ｐ等；有强心利尿作用，降低血管通透性及脆性，防止渗血，其煎剂有镇吐作用，能抗洋地黄及阿朴吗啡引起的呕吐，还有抗肝损伤的作用［１５］徐刚等［４］报道，由黄芩、金银花和连翘组成清热方降温的机制之一为降低下丘脑Na-／Ca-比值。诸药合用，具有解热，抗内毒素等作用。本实验也表明该方对内毒素所致病变有一定缓解，修复的作用。3.2.2.2

西药复方中,安乃近有解热镇痛、消炎抗风湿的作用，其主要机理是抑制下丘脑的PG合成活性，减少了PG的生物合成[21,22]。环丙沙星属于喹诺酮类抗生素，是DNA回旋酶抑制剂，抑制DNA解旋、复制，从而使细菌蛋白质合成受限制。王顺宾[23]认为它除了作用于DNA回旋酶时才可以抑制细菌蛋白质合成，导致细菌生长停止，增殖减弱而死亡，此类药物使革兰氏应阴性细菌释放内毒素缓慢，量低的特点，但环丙沙星是由于能引起细菌丝状改变，仍可导致内毒素的大量释放[24]。其诱导释放内毒素的量还与药物浓度有关，高浓度时释放内毒素量减少[23]。环丙沙星也可以与膜表面的缓慢死亡的Ga2+结合而引起内毒素释放[24]。梁晋全[25]认为头孢菌素和喹诺酮类可导致细菌快速溶解，致使内毒素释放，而氨基糖甙类则引起细胞的缓慢死亡，使内毒素不断释放出来。梁存河等[26]人则认为喹诺酮类抗生素大多使细菌形成丝状体，致内毒素释放增加，环丙沙星尽管使细菌形成丝状体，而由于迅速杀菌作用可使内毒素释放减少。该组复方有较好的抗菌，抗内毒素，解热作用，缓解内毒素对动物组织器官的损伤。3.3研究的意义与展望虽然人们对内毒素结构、生物学活性及致病机制，内毒素疾病的病理生理过程有关的认识取得了显著的进展，但目前国内外仍无一种疗效明显、不良反应低、价格低廉的治疗内毒素感染比较理想的药物。尽管采用了日益完善的器官支持和重症监护技术；及以抗内毒素抗体，抗炎性细胞因子（炎症介质）抗体或炎性细胞因子受体拮抗剂等新药，但重症革兰氏阴性菌感染引起的内毒素所致全身炎症反应综合症（SIRS），以及由此而来的多脏器功能失常综合症（MODS）其病死率却一直居高不下[3，27，28]。因此，研制高亲和力、能中和内毒素且毒素低的抗内毒素新药对内毒素感染性疾病的防治具有重要的意义。回顾现代医学对内毒素的种种治疗措施，可以看出大多数是在对抗性干预内毒素及其诱发的炎症介质策略指导下进行的，末能综合考虑内毒素血症的全身性病理生理状态。因而其治疗效果就有一定的局限性。如TNF-a和TNF-1B被认为是内毒素诱导的引起机体细胞炎症损害最重要的炎症介质[29,30]