毕赤酵母翻译

Glycoengineered（糖基化工程）毕赤pastoris（毕赤酵母）中表达的重组单克隆抗体的纯化工艺开发摘要一个强健的和可扩展的净化过程被开发快速从glycoengineered毕赤酵母发酵生成抗体的纯度高、数量充足。蛋白A亲和层析用于捕获从发酵液抗体。PH梯度洗脱已应用到要防止抗体沉淀在低pH的蛋白A列。从蛋白抗体色谱法所载一些产品的相关杂质，被劈重链、重链和轻链的misassembling。它也有一些处理相关的杂质，包括蛋白A残留、endotoxin（内毒素）、宿主细胞DNA和蛋白质。Ph值为4.5-6.0的最优氯化钠渐变阳离子交换色谱法有效去除这些产品和过程相关的杂质。从glycoengineeredP.酵母抗体是其heterotetramer折叠、物理稳定性和约束力的亲和性的商业同行相媲美。介绍单克隆抗体（Mab）正迅速成为关键产品的生物医药产业。大多数商业治疗性抗体是原封IgG分子与IgG1、IgG2正在共同的子类。这些IgGs由调解抗原和效应器函数之间的联系，在免疫过程中发挥中心作用。对目标细胞的特异性抗原的igg抗体可变域的绑定将抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）及补体依赖性细胞毒性（CDC）定向杀害的目标单元格。ADCC触发由交联体Fc域的IgG抗体（Fc（Rs），尤其是Fc（RI和Fc（制证机对免疫效应细胞。可能调解ADCC效应细胞包括自然杀手细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。疾病预防控制中心是由补充组件C1q绑定到IgG，触发蛋白水解的级联，以激活补充fc功能区启动。IgG型抗体有两重链和两条轻链由分子内的二硫键形成heterotetramer在一起。重链是通过共价键固定在天冬酰胺297（Asn-297）低聚糖的糖基化。人免疫球蛋白的主要N-聚糖复杂biantennary（二分支的）类型，有核心'heptasaccharide（七庚糖），GlcNac2Man3GlcNac2，被称为G0在我们的工作和文学。其他的糖分残留可能会附加到'核心'要进一步生成复杂biantennary宇辉结构，如GalGlcNac2Man3GlcNac2（G1），Gal2GlcNac2Man3GlcNac2（G2）Neu5Ac2Gal2GlcNac2Man3GlcNac2。目前，治疗单克隆抗体是在哺乳动物细胞，主要是在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株生产的。在哺乳动物细胞中生产的重组抗体的宇辉配置文件是主要是异类。非均质性可以变化广泛克隆克隆，是取决于生产和文化条件的模式。抗体宇辉配置文件可以有重大的影响ADCC和疾病预防控制中心。DeglycosylatedIgG显示没有激活ADCC和疾病预防控制中心的能力。Rituximab（利妥昔单抗），嵌合的人权小鼠人性化抗CD20单克隆抗体，生产的glycoengineered毕赤酵母中有两个较高亲和力向Fc（RIIIa和更大B细胞耗竭效价比从CHO细胞生产的对应。N-聚糖从治疗单克隆抗体在哺乳动物细胞中生产主要是fucosylated（岩藻糖基化），在这一个fucose（岩藻糖）残留物附加到主的N-乙酰氨基葡萄糖残留。它表明聚糖fucosylation影响ADCC和疾病预防控制中心的功效。例如，关于人类IgG1afucosylated聚糖可以显著提高IgG1绑定到Fc（制证机和增强ADCC功效，但并不影响绑定到Fc（RI或C1q。这些结果表明可能通过生成特定的抗体glycoform优化抗体介导的效应的功能。酵母是一个广泛使用的重组蛋白表达系统。但是，在野生型酵母生产的糖蛋白包含潜在免疫原性高甘露糖类型限制为治疗蛋白和抗体生产的酵母表达系统使用的N-聚糖。在酵母中的抗体表达的另一个挑战是重型和轻型链要形成heterotetramer的程序集。一般情况下，在酵母表达分泌的抗体是黑腹为主或重型和轻型链的单体。此抗体大会问题可能与有关降低效率的抗体可折叠、加工和分泌的酵母有高甘露糖时键入N-聚糖。人类糖基化的途径是入酵母体育中执行特定的人性化的N-糖基化反应与高保真设计出来。Glycoengineered细胞株的P.酵母中成功制造了重组蛋白和单克隆抗体与人性化的N-连接糖结构。利妥昔单抗产生不同glycoengineered细胞株的P,酵母中可以正确装配形成heterotetramer和从CHO细胞展示商业利妥昔单抗相同抗原结合的特点。在哺乳动物细胞培养、蛋白A亲和层析是广泛用于纯化的第一步直接捕获单克隆抗体产品ph值为中性。通常从蛋白A列在低pH洗脱的产品包含过程和产品相关的杂质。这一进程有关的杂质包括内毒素、浸的蛋白A、宿主细胞蛋白质和DNA。该产品相关的杂质主要是聚合和修剪单克隆抗体产品。若要删除这些杂质，一般采用第二和第三色谱的步骤，通常从色谱阳离子交换（CEX）、阴离子交换色谱法（AEX）、疏水层析（HIC）、疏水性充电感应色谱（信息中心）和羟基磷灰石色谱中选择。在我们的研究从哺乳动物细胞培养的许多单克隆抗体纯化过程不工作好删除产品相关的杂质从P.酵母发酵。我们以前用于蛋白A亲和层析和HIC苯基琼脂糖凝胶净化从glycoengineeredP.酵母中少量的利妥昔单抗。最近，规模较小，非优化的版本，本文介绍的方法用来净化小额从glycoengineeredP.酵母发酵的单克隆抗体。人性化的反-HER2/东大受体IgG1单克隆抗体作为示例用于研究单克隆抗体生产的glycoengineeredP,酵母。一个强大且可扩展的分离纯化过程是由优化工艺条件为蛋白A和阳离子交换产物开发的。这一进程有效去除产品的相关杂质和进程相关的残余蛋白A、宿主细胞DNA和内毒素的杂质。克的高度纯净抗HER2人与生物圈方案很容易被从P.酵母发酵时支持生化特性和动物研究生成。从glycoengineeredP.酵母中抗HER2人与生物圈是可比较的与其对应商业（曲妥珠单抗）在heterotetramer折叠式、物理稳定性和亲和力的抗原，Fc制作的CHO细胞（RIC1q。此外，抗HER2单克隆抗体生产和在体育中酵母本身就是afucosylated。材料和方法材料精简蹄筋（80——粒子大小），MabSelect肯定（粒子大小）、源30多岁（粒子大小）、GE医疗集团（热身赛的获得了mCaptoS（ 粒子大小平、SP琼脂糖凝胶高性能（HP）（ 粒子大小）、90m 34mSP琼脂糖凝胶快速流（FF）（45—— 粒子大小）、XK26/40、XK16/40和蓬乱10/200列、新泽西州、美国）「波罗斯岛50HS（m粒子大小）是从Perseptive生物系统（美国马萨诸塞州弗雷明汉）。化学品是从JT贝克（菲利普斯堡，新泽西州，美国）或西格玛一一奥尔德里奇（圣路易斯，密苏里州，美国）。所有缓冲区被都筛选与Nalgene聚醚飒膜过滤器（ 孔隙大小）（罗切斯特，纽约州，美国）。 是从匠（哥廷根德国）。矢量抗人IgG-AlexaFluor488^，p9ICZA，^iCo§reen®剂和）4-甲基伞形酮磷酸（4-MUP）是从Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。共轭链霉亲和——碱性磷酸酶（AP）是从栽（麦迪逊，无线，美国）。4 20%招聘 HCl准备好凝胶和Prestained SDS标准（广泛范围）是从生物Rad实验室（大力神，加利福尼亚州，美国）。Fc（RI是从R&D系统（美国明尼苏达明尼阿波利斯）。人类C1q是从美国生物（美国马萨诸塞州斯旺普斯科特）。从生物界（美国马萨诸塞州剑桥）是抗C1q多克隆抗体-AP共轭。根据前面所述的方法被建造单元格行和发酵抗HER2人与生物圈P.酵母中表达细胞株。简单地说，重型和轻型链基因被极量到pPICZA矢量，转换为glycoengineeredGFI5.0应变。单元格行是为人与生物圈方案表达效价和N-糖基化配置文件转化的菌株筛选后选定的。根据前面所述的方法进行了15和40L生物反应器中的发酵。发酵液是由15,800g30min离心法恢复和由 通过过滤澄清。SARTOPORE2（0.8+0.45m）柱层析法与AKTA资源管理器100系统从GE医疗集团（美国新泽西州热身赛）在室温下进行了所有色谱试验。流率被选为有5分钟的停留时间列，除非它具体表明。紫夕卜线吸收的蛋白质进行了监测在280nm。A蛋白亲和层析，以确定蛋白结合能力为人与生物圈方案从P.酵母发酵的色谱，精简蹄筋AMabSelect确定列平衡20毫米招聘，ph值7.0中五柱床体积（CV）和被加载与发酵上清液，ph值7.0，要完全饱和的列绑定能力。随后，列洗一次与20毫米招聘，ph值7.0，1M氯化钠（3CV）和弱酸线性梯度，降低ph值从5.0到3.0的100毫米柠檬酸钠或不1M精氨酸（10CV）。A280nm高峰千里马在pH测量从AKTA资源管理器100系统出水中。代表人与生物圈峰值的分数被汇集蛋白浓度测定。蛋白A列绑定能力，（单克隆抗体每毫升树脂的流动速度肯定会有5分钟的列驻地时间量）被从蛋白的洗脱分数按照下列公式计算：结合能力=VEXCE/VRVE，卷的体统（ml）；CE、蛋白浓度在体统分数（mg/ml）；VR，蛋白A树脂（毫升）列中的容量。阳离子交换色谱法简化蹄筋纯净的抗HER2人与生物圈用于阳离子交换色谱法发展。阳离子exchangeresins在蓬乱10/200（1厘米身份x19厘米）平衡与ph值4.5醋酸钠25毫米（5CV）、满载45毫克的IgG1ph值为4.5和pH5.0醋酸钠25毫米用清水洗净(2CV)之前色谱分离。使用源30多岁的色谱分色，SP琼脂糖凝胶高性能、CaptoS和波罗斯岛50HS都在进行线性渐变从0到300mM氯化钠(10CV)醋酸钠25毫米，在ph值5.0跟随由500毫米氯化钠(3CV)相同的钠醋酸缓冲。源30S色谱分离在从0到300mM氯化钠的线性渐变进行(10CV)在25毫米无水醋酸钠Ph值为4.5和5.0分别为何；在ph值为6.0磷酸12.5毫米钠醋酸钠12.5mm。后线性梯度洗脱，列不断洗脱以500毫米氯化钠(3CV)与相同ph值的缓冲区中。源30年代逐步渐变色谱法在100毫米执行与氯化钠(3CV)，125毫米(3CV)，150毫米(3CV)，175毫米(3CV)300毫米(2CV)和500毫米(2CV)在pH5.0醋酸钠25毫米。制备型色谱运行精简蹄筋A树脂被装在一个XK26/40列(2.6厘米的身份证X28厘米)和被平均20毫米招聘ph7.0(5CV)。列是加载与7L发酵上清液，ph值7.Q洗后再用以下洗涤议定书》规定：(1)20毫米招聘ph值7.01M氯化钠(4CV);(2)20毫米招聘，pH7.0(2CV);(3)20毫米招聘ph值7.0乙二胺四乙酸10毫米、10毫米小伙子们(6CV);(4)20毫米招聘pH7.0(4CV)。列然后被洗脱用线性渐变从ph值降低4.0到3.0的100毫米柠檬酸钠(3CV)随pH3.0(5CV)。流动率是21毫升/分钟。弱酸的分数被调整到与1米磷酸钠，二元，ph值8.9pH5.0分数表示IgG1高峰被汇集为下一步纯化。源30S树脂被装在一个XK26/40列(2.6厘米的身份证X28厘米)和平衡与ph值4.5醋酸钠25毫米(5CV1从简化蹄筋池用水稀释五倍抗HER2人与生物圈(电导率-10mS/cm)、调整到与1M醋酸，pH4.5和列上，然后加载。根据上述协议进行了逐步渐变源30S色谱法。流率是10毫升/分钟流量快速SP琼脂糖凝胶树脂被装在一个XK16/40列(1.6厘米身份X35厘米)和平衡与缓冲区A(5CV。抗HER2来自源30多岁的人与生物圈是用缓冲区A稀释五倍和SP琼脂糖凝胶列上加载。后缓冲区洗涤(5CV),人与生物圈洗脱与5列从制订缓冲区pH6.Q150mM氯化钠，0.01%吐20组氨酸10毫米)的简历。馏分的高峰期是作为最终产品汇集、通过0.2聚醚飒膜过滤器过滤和菌存放在4C0蛋白质浓度抗HER2单克隆抗体浓度由测量他在2801厘米石英试管中的吸收毫微米与紫外线分光光度计。使用了1.42Lg-厘米-1从氨基酸序列计算的理论消光系数。纯化的抗HER2人与生物圈方案被集中的物理稳定性分析和交换制订缓冲区中的缓冲区。调整到10毫克/毫升制订缓冲区中的抗体并将其存储在不同温度下的4、25、37°C。它分析了每周的大小排除色谱(SEC)来确定聚合和退化为六个星期。使用ZorbaxGF-250( 粒子大小)列、9.4X250毫米L7420紫外探测器监测280的日立D7000高效液相色谱法系统(日立，东京，日本)上进行了分析秒毫微米。样本量是 和流动相是100毫米磷酸钠、ph值6.8,150mM氯化钠0.05%叠氮化钠在1.0m'l/min的流量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS——页）和双向凝胶电泳SDS——根据具有修改4的Laemmli方法进行x非减少样品缓冲（250毫米招聘，ph值6.88%sds,40%v/v甘油，0.4%漠酚蓝钠盐，100毫米Nethylmaleimide）和4x减少样品缓冲（250毫米招聘，ph值6.88%sds,40%v/v甘油，0.4%漠酚蓝钠盐20%v/vb-巯基乙醇）。凝胶是沾满了0.025%考马斯辉煌蓝R250在7%v/v醋酸aci山40%v/v甲醇和destained在10%v/v乙酸60分钟。双向电泳技术是由肯德里克实验室，Inc.（美国无线麦迪逊）执行的标准格式。简单地说，等电聚焦（IEF）在进行了用2%ph值3.5——10混合的ampholines玻璃管4L.PH梯度情节确定与表面pH电极和六个国际盛事基金管凝胶（运行与缓冲区）。原肌球蛋白等电点pI,5.2）列入作为内部的标准样品。从国际盛事基金管凝胶然后被密封到10%丙烯酰胺板凝胶运行SDS平板凝胶电泳的顶部。丙烯酰胺板凝胶是沾上考马斯亮蓝和之间的玻璃纸床单晒干。蛋白质的pl是使用供应商提供的梯度情节的ph值确定的。内毒素分析内毒素是使用由查尔斯河Endosafe（美国马萨诸塞州威明顿）提供的终点显色鲎试剂裂解液（LAL）方法确定的。残余蛋白分析残余蛋白A确定所述与作了一些修改96井过滤塔中捕获了一种标准和样品的蛋白涂有反蛋白多克隆抗体。素抗蛋白多克隆抗体被添加到板上形成免疫复合物与捕获蛋白A.复杂检测到与共轭链霉亲和AP,其次是基板4MUP。该产品由阅读与360进行激发荧光定量毫微米、排放在485nm。通过使用PicoGreen试剂根据指令从Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）确定宿主细胞基因组DNA分析宿主细胞基因组DNA。N-连接糖分析N-连接糖配置文件确定基质辅助激光解吸/电离/-飞行时间质谱法测定（解吸电离质谱）使用航海家号德™BioSpectrometry™工作站福斯特市，加利福尼亚州，美国应用生物系统）如上文所述具有约束力的测定抗原结合分析法使用SKBR3细胞（美国类型文化收藏）所述稍作修改与执行。人与生物圈方案 抗原复杂被斑斑IgGAlexaFluor488antihuman。番石榴表示加上（番石榴技术、唐熙华，加利福尼亚州，美国）检测到荧光强度（MFI）的意思是利用励磁488nm和排放在525nm。C1q结合分析法进行细微的修改与所述。人与生物圈-C1q复杂检测到与反C1q多克隆抗体-AP共轭，其次是基板4MUP。该产品通过阅读相对荧光单位（所）与励磁在360量化毫微米、排放在485nm。Fc（RI绑定测定方法进行了如上文所述。结果和讨论A蛋白亲和色谱仪为抗HER2单克隆抗体纯化蛋白A亲和层析是单克隆抗体纯化的常用方法。精简的蹄筋A专供抗体纯化直接从原油原料的膨胀的床吸附色谱法。MabSelect肯定是基因工程蛋白A亲和树脂提高了碱稳定性为列再生和净化处理。MabSelect确定陈列野生型蛋白A树脂，包括MabSelectXtra和ProSepvA超可比绑定的能力。我们比较P.酵母发酵液抗HER2单克隆抗体纯化的简化型蹄筋A和MabSelect确定列绑定能力。这两个列有类似绑定容量30毫克/毫升（表1），这是用纯化的人类IgG确定其绑定能力相媲美。因此，我们使用两个列以捕获从P.酵母发酵液抗HER2人与生物圈方案和评价其洗脱条件。抗体是常规地洗脱从蛋白A亲和层析在低ph值（3.0）。然而，抗体稳定在低ph值（2.5——3.5）并不倾向于聚合。洗脱缓冲液具有更高的ph值被用于减少聚合，导致不完整洗脱抗HER2单克隆抗体。精氨酸已被作为一种替代的策略以提升洗脱的ph值，防止抗体蛋白A亲和层析中的聚合。若要优化抗HER2单克隆抗体洗脱条件，我们比较蛋白A色谱与无洗脱pH（5.0-3.0）减少渐变中的精氨酸。总结在表1中，在A280nm峰值千里马pH出现pH3.3流线型蹄筋A色谱中，在pH3.7MabSelect肯定色谱中时抗HER2人与生物圈方案通过从100毫米柠檬酸钠pH5.0到3.0的线性渐变降低洗脱从这两个列。Ph值最大值被转移了3.7精简蹄筋A色谱中，当1M精氨酸被列入。超过90%的人与生物圈被痊愈的蛋白A列中每个这些洗脱条件（表1）。没有人与生物圈方案后洗脱树脂（未显示的数据）中检测到。由洗脱用降低ph值线性渐变中存在1M精氨酸防止抗体沉淀。考虑到其低压力降在柱层析，我们选择了在规模向上分离纯化过程中使用精简蹄筋A并执行没有精氨酸pH梯度洗脱洗脱缓冲液中。阳离子交换色谱法若要移除产品相关杂质A中蛋白纯化抗HER2人与生物圈方案从P.酵母中，有一些产品相关的杂质的不同从观察到在其他表达系统中的杂质。在评估不同产物包括CEX、AEX、HIC、信息中心和羟基磷灰石色谱之后,我们发现那阳离子交换色谱法可以执行好，除去这些杂质。图1A比较阳离子交换色谱执行与ph值为5.0相同氯化钠线性梯度洗脱。图谱的源30多岁，波罗斯岛50HS和SP琼脂糖凝胶HP所有表现良好峰值的决议。然而，峰值决议CaptoS色谱这可能是由于它的大颗粒大小，暗示源30多岁、波罗斯岛50HS和SP琼脂糖凝胶HP能执行好，除去杂质在消失了。若要确定最佳ph值为氯化钠梯度洗脱，我们比较源30S图谱与氯化钠线性梯度不同ph值为4.5、5.0和6.0。如图1B所示，ph值为4.5和5.0，但一些重叠在前两个洗脱峰ph值为6.0有好的决议。要发展容易放大净化过程，我们优化源30S色谱与氯化钠梯度分离。如图1所示，洗脱峰被好分开在不同浓度NaCl在pH5.0醋酸钠25毫米。图1描述了SDS——分析这些山峰中的样本。第一次的洗脱峰在100mM氯化钠所载misassembled重伤和抗HER2单克隆抗体，其中的轻链组成重伤和重链,作为证实由N-末端氨基酸序列（数据不会显示）。第二次的洗脱峰在125毫米氯化钠载完好无损抗HER2人与生物圈与几个产品相关的杂质。小洗脱峰或以上150mM氯化钠被misassembled单克隆抗体，其中的重链、劈重链和轻链的混合物组成。这些结果表明在蛋白质纯化的抗HER2人与生物圈方案从glycoengineeredP.酵母中，产品相关的杂质来自misassembling劈重链、重链和轻链。阳离子交换色谱法在最优氯化钠梯度ph值为4.5-6.0，可以有效去除这些杂质。规模向上净化过程基于上述优化小柱纯化的条件，我们开发了强大且可扩展的纯化工艺生产的高品质抗HER2人与生物圈方案从10到40LP.酵母发酵的克。后经过发酵上清液通过简化蹄筋A列，非特定绑定杂质被从列通过洗涤，和抗体以降低ph值4.0到3.0从梯度洗脱。抗体池从靶点色谱法是以五折的量减少到10mS/cm电导率用水稀释，直接应用到源30列若要移除产品相关的杂质。抗体被洗脱ph值为5.0使用逐步氯化钠渐变。最后，从源30列抗体是应用于SP琼脂糖凝胶快速流动的列和洗脱与制订缓冲区作为最终产品。此分离纯化过程消除了耗费时间缓冲区交换过程之间每个色谱法步骤，可能会引入蛋白质降解和聚合。图2A显示SDS——分析的每一步纯化过程中的抗HER2单克隆抗体产品和其商业对应产品，曲妥珠单抗在CHO细胞生产。数据表明我们两步纯化过程可以产生抗HER2人与生物圈方案从P.酵母发酵和实现曲妥珠单抗作为同一纯度。此分离纯化过程一般被用来净化其他IgG1、IgG2和IgG4的单克隆抗体，针对不同的抗原。图2B是其他三个代表性mAbs从glycoengineeredP.酵母中的SDS——分析和演示产品的高效去除相关杂质，达到纯度高。表2概述了抗HER2单克隆抗体纯化过程的结果。所含的蛋白A纯化的抗HER2产品约20%的产品相关杂质，完全被从完好的抗体产品源30S色谱法。分离纯化过程表明生产最后抗HER2单克隆抗体产品的纯度为99%，实现60%的总体恢复从捕获的蛋白A蛋白质。抗HER2蛋白的单克隆抗体亲和层析所载290ppm的残余蛋白A，共同洗脱抗体从列。源30S和SP琼脂糖凝胶色谱法后,残余蛋白A500-fold几乎减少了到0.6ppm（表2），最终产品中。蛋白A纯化抗HER2单克隆抗体了低水平的宿主细胞DNA（<7ppm）和内毒素（0.6欧盟毫克）。在最终产品中，宿主DNA进一步减少了超过20倍到<0.3ppm和内毒素2折减至0.3欧盟/毫克俵2）。宿主细胞蛋白杂质，最终产品中的几乎没有检测到使用多克隆抗体内部免疫印迹法检测。多克隆抗体在兔用毕宿主细胞蛋白作为抗原（数据不会显示）提出。通过使用秒来检测聚合或降解表征抗HER2单克隆抗体单克隆抗体抗HER2从glycoengineeredP.酵母中的物理稳定性进行了评估。抗HER2人与生物圈方案制订缓冲区中的被存储时4、25、37oj为期六个星期，没有大量的聚合或降解检测到由