微生物的选择培养和计数【知识精讲精研+备课精准突破】 高二生物 课件（人教版2019选择性必修3）

1.2.2微生物的选择培养和计数本节聚焦怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？测定微生物数量的常用方法有哪些？情境问题：某研究小组想在土壤样品中分离得到能分解尿素的细菌，但是土壤中还有许多其他微生物，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现，该怎么办呢？科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。美国黄石公园实验室中如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。思考：为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？培养基中加青霉素具有青霉素抗性的菌落培养基应有菌落没有青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗青霉素能力的细菌?举例1一选择培养基选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基。类型条件分离得到的菌种（1）改变培养条件（2）添加某种化学物质（3）营养缺陷70～80℃的高温水生栖热菌加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌不加含碳有机物不加氮源自养型微生物固氮菌思考-讨论尿素的立体结构

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。讨论1：你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？讨论2：该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。细菌利用尿素的原因他们能合成脲酶。CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二2.从用途上来讲，培养基二属于

培养基，目的是为了获得

。3.两种培养基共有的培养基成分有：

。培养基一的碳源为

，氮源为

；培养基二的碳源为

，氮源为

。1.从物理性质来讲，两者属于_____

培养基，判断依据是______________________。固体添加了凝固剂琼脂选择能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基一KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二4.是否能根据选择培养基和完全培养基上的菌落数目来证明选择培养基具有筛选作用？完全培养基的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数同理：将土壤稀中能分解纤维素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基,用纤维素作为唯一碳源,可以将分解纤维素的细菌分离出来设计一种选择培养基,用石油作为唯一碳源,可以将分解石油的细菌分离出来思考：将土壤中能分解石油的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？一选择培养基

情境问题：某研究小组想知道1g土壤样品中有多少能分解尿素的细菌，方法是？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量二微生物的选择培养

分离方法：稀释涂布平板法2、实验的具体操作：（2）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌（1）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基1、稀释涂布平板法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。二微生物的选择培养（3）样品的稀释将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水二微生物的选择培养①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中滴②取少量稀释液（不超过0.1ml

），滴加到培养基表面灼③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。涂④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。浸（4）涂布平板：二微生物的选择培养微量移液器涂布平板法操作（5）培养与观察二微生物的选择培养稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。

培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。

ABC二微生物的选择培养（5）培养与观察防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。方法一：稀释涂布平板法（活菌计数法）三微生物的数量测定阅读教材P18，回答下列问题：1.为什么通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中的活菌数？2.统计菌落数目时，选择菌落数范围为多少的平板？3.在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数求平均值的原因是什么？4.统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是什么？在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。30—300重复实验当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落方法一：活菌计数法（稀释涂布平板法）（1）原理：

三微生物的数量测定（2）统计原则：（3）结果:①选30∼300个菌落的平板统计；②每个稀释度取3个平板，取其平均值；原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？（80+90+100）/30.1×105=9×107个（4)如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？三微生物的数量测定两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？实例分析2：

乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。三微生物的数量测定甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）方法2：显微镜直接计数法不能区分死菌和活菌血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。三微生物的数量测定思考：统计的菌落数往往比活菌的实际数目多，原因是什么？资料：酚红指示剂是一种常用的酸碱指示剂，在PH为6.6—8.0时显示橙色，PH低于6.6显示黄色，PH高于8.4呈现红色。分解尿素的细菌能产生脲酶，脲酶将尿素分解成了氨，培养基PH升高，可使酚红指示剂变红。脲酶阴性脲酶阳性进一步探究思考：结合所给资料，说出如何对分离的菌种进行鉴定？在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂。鉴别培养基是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。

到生活中去测定饮水中大肠杆菌数量的方法：鉴别培养基二、拓展应用练习与应用（P20）二、拓展应用（2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。（3）这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。练习与应用（P20）二、拓展应用

1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。练习与应用（P20）方法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种②都是在固体培养基上进行的平板划线法稀释涂布平板法【归