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文档简介

实验原理原代细胞培养保持了原来正常细胞的主要特性，经常用于许多病毒的首次分离。本试验以鸡胚成纤维细胞制备和培养为例，介绍一下原代细胞的培养过程。实验器材试剂器材：倒置显微镜、超净工作台、培养箱、水浴锅、照蛋器等试剂：培养基（生长液+维持液）（含血清）PBS缓冲溶液消化液（0.25%胰酶）实验方法细胞原代培养的步骤（1）取胚及剪碎取9-11日龄的鸡胚，用照蛋器观察后，将胚蛋气室端向上，用酒精消毒气室，以镊子击碎卵壳。沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，以缓冲溶液冲洗体表数次，移入灭菌小瓶中，再用剪刀剪成小块，约1mm3大小的碎块，以缓冲液冲洗体表数次。实验方法（2）消化加37℃预热的0.25%胰酶适量，（一个鸡胚约需5ml胰酶），37℃水浴消化15-20min，其间，每5min轻摇一次，至液体变得浑浊粘稠。此时，再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下降时，则终止消化，弃去胰酶，再以缓冲溶液冲洗三次。实验方法（3）吹打和过滤以培养液悬浮沉淀细胞，经大口吸管反复吹打数次，使细胞分散。经8层纱布过滤，收集滤液后离心，再加入培养液，制备细胞悬液。实验方法（4）细胞计数取上述细胞悬液0.5ml加入0.1%的结晶紫-柠檬酸盐溶液，室温染色5-10min。用微量移液器吸取滴入细胞计数板内，在显微镜下计数，调整细胞浓度至106个/ml。（5）分装培养将细胞悬液分装于细胞培养瓶中，于二氧化碳培养箱中37℃培养。24h-36h长成单层的细胞，此时可吸去培养液，更换维持液。注意事项细胞培养所用的各种器皿必须严格消毒灭菌，所有的溶液都要用三蒸水配置。组织消化的时间要进行预实验，摸索消化的最佳条件。细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱时，瓶盖不要拧得太紧，保证气体能进出。各步骤严格进行无菌操作，防止

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