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文档简介
实验原理原代细胞培养保持了原来正常细胞的主要特性,经常用于许多病毒的首次分离。本试验以鸡胚成纤维细胞制备和培养为例,介绍一下原代细胞的培养过程。实验器材试剂器材:倒置显微镜、超净工作台、培养箱、水浴锅、照蛋器等试剂:培养基(生长液+维持液)(含血清)PBS缓冲溶液消化液(0.25%胰酶)实验方法细胞原代培养的步骤(1)取胚及剪碎取9-11日龄的鸡胚,用照蛋器观察后,将胚蛋气室端向上,用酒精消毒气室,以镊子击碎卵壳。沿气室周围剪去卵壳,撕去壳膜和绒毛尿囊膜,取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏,以缓冲溶液冲洗体表数次,移入灭菌小瓶中,再用剪刀剪成小块,约1mm3大小的碎块,以缓冲液冲洗体表数次。实验方法(2)消化加37℃预热的0.25%胰酶适量,(一个鸡胚约需5ml胰酶),37℃水浴消化15-20min,其间,每5min轻摇一次,至液体变得浑浊粘稠。此时,再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下降时,则终止消化,弃去胰酶,再以缓冲溶液冲洗三次。实验方法(3)吹打和过滤以培养液悬浮沉淀细胞,经大口吸管反复吹打数次,使细胞分散。经8层纱布过滤,收集滤液后离心,再加入培养液,制备细胞悬液。实验方法(4)细胞计数取上述细胞悬液0.5ml加入0.1%的结晶紫-柠檬酸盐溶液,室温染色5-10min。用微量移液器吸取滴入细胞计数板内,在显微镜下计数,调整细胞浓度至106个/ml。(5)分装培养将细胞悬液分装于细胞培养瓶中,于二氧化碳培养箱中37℃培养。24h-36h长成单层的细胞,此时可吸去培养液,更换维持液。注意事项细胞培养所用的各种器皿必须严格消毒灭菌,所有的溶液都要用三蒸水配置。组织消化的时间要进行预实验,摸索消化的最佳条件。细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱时,瓶盖不要拧得太紧,保证气体能进出。各步骤严格进行无菌操作,防止
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