代谢工程中一个乳酸菌双乳酸脱氢酶敲除提高以乙醇的产生(个人翻译 仅供参考)

代谢工程中一个乳酸菌双乳酸脱氢酶敲除以提高乙醇的产量摘要乳酸菌通过Embden-迈耶霍夫-帕纳斯（EMP）途径发酵葡萄糖：中间代谢物丙酮酸通过乳酸脱氢酶（LDH）的作用转化为乳酸。用丙酮酸脱羧酶（PDC）取代乳酸脱氢酶（LDH）对丙酮酸进行催化作用,可以使丙酮酸生成乙醇从而代替乳酸的产生。将一个革兰氏阳性菌——胃八叠球菌（Spdc）的丙酮酸脱羧酶（PDC）基因引入到一个植物乳杆菌TF103乳酸脱氢酶缺陷型菌株中，使其中ldhL和ldhD基因失活。在胃八叠球菌和S.ventriculi（—种菌株）启动子或三个乳酸乳球菌启动子中的四个不同的融合基因中的PTRKH2（厌氧靶向自杀基因）被引入到TF103中。检测所有四个重组株的丙酮酸脱羧酶（PDC）的活性。通过对工程菌生产乙醇和其他代谢产物在烧瓶中的发酵来检验工程菌。重组菌株的生长略快于亲代TF103并且生产90——130毫米的乙醇。虽然产生的略多的乙醇是明显的，但是碳元素向乙醇代谢的途径并没有得到显著改善，因此建议进一步了解了这个有机体的新陈代谢是必要的。关键字：乙醇发酵；代谢工程；乳酸菌；丙酮酸脱羧酶；胃八叠球菌（SPDC）正文介绍乳酸菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性菌。乳酸菌通常缺乏呼吸链，它们利用发酵产生的一系列糖类来提供能量用于细胞的维护和生长。在乳酸菌的发酵中，乳酸是发酵的终产物，而在异型乳酸发酵细菌的发酵中，通常戊糖通过磷酸乙酮醇酶途径（PPT途径）产生的是乙醇、二氧化碳、醋酸和乳酸的混合物。乳酸菌一般被认为是安全的，天然的乳酸菌已经被应用于发酵工业中。近年来，人们研究基因改造乳酸菌用于生产乳酸、B族维生素、低热量糖醇如山梨醇和甘露醇。乳酸菌可以在较低的pH值条件下生长，并且很多菌株是耐乙醇的。这些特点都有助于开发新的微生物用于发酵木质纤维素生物质生产乙醇。将纤维素转化为乙醇，要求微生物能够，发酵从水解木质纤维素生物质中释放出来的葡萄糖和木糖糖类。许多乳酸菌可以代谢多糖，包括戊糖。因此，对于代谢工程中的生物质生产乙醇来说，它们似乎是理想的宿主。但是，乳酸菌不会生产大量的

乙醇，因为它们会将糖发酵成乳酸。本实验研究的目的在于，利用植物乳杆菌作为模式菌株，用于探索使其从产生乳酸转而产生乙醇的能力的可能性。负责使丙酮酸产生乙醇的酶有丙酮酸脱羧酶（PDC;EC4.1.1.1）和乙醇脱氢酶（ADH;EC1.1.1.1）。丙酮酸脱羧酶（PDC）催化丙酮酸脱羧产生乙醛和二氧化碳，然后乙醛通过乙醇脱氢酶催化变为乙醇。Mobilis的运动发酵单胞菌中生产乙醇的基因pdc和adh被整合在一个便携式的pet操纵子中。理论上，将pet操纵子引入到大肠杆菌中，乙醇的收益率可能在86——92%。pet操纵子也被引入到革兰氏阳性菌和乳酸菌菌株中。这些重组的菌株很少或者不能产乙醇，这表明源于革兰氏阴性菌的pdc基因不能在革兰氏阳性菌中发挥适当的功能。这可能是由于革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌种类之间对于密码子的偏好性和/或基因表达的显著差异所造成的。与普遍存在于许多生物包括细菌中的乙醇脱氢酶（ADH）不同，虽然丙酮酸脱羧酶（PDC）广泛的分布在植物中，但是它们只能在少数种类的细菌中才能被找到。最近才得到描述的在革兰氏阳性菌中仅有的pdc基因来自于胃八叠球菌（SPDC）。在酸性条件下（pH3.0）,S.ventriculi利用丙酮酸脱羧酶（PDC）使碳元素和电子的流向从流向醋酸、甲酸、和乙醇改变为主要流向乙醇。S.ventriculi的丙酮酸脱羧酶（PDC）是被丙酮酸激活的并且符合S形动力学，类似真菌和高等植物的酶符合米氏动力学。这种革兰氏阳性菌Spdc基因中G+C密码子的低频率使用，为革兰氏阳性菌工程宿主对于丙酮酸脱羧酶（PDC）高水平的表达和开发第二代可以使用生物质糖产乙醇的微生物提供了可能。本文的目的是确定革兰氏阳性菌一一胃八叠球菌（Spdc）可以在植物乳杆菌中功能性表达，并且测试是否有一种乳酸缺陷型的植物乳杆菌菌株能够被采用主要用来发酵生产乙醇。材料与方法菌株与生长条件Goodwin和Zeikus如上述在厌氧条件下培养S.ventriculiJK。Ferain博士提供了植物乳杆菌NCIMB8826衍生株TF103。TF103菌株是D型和L型乳酸脱氢酶活性的缺陷型菌株，培养在37°C、100rpm（转/每分钟）添加了氯霉素（10卩g/ml）或红霉素（5》g/ml）MRS液体培养基中。大肠杆菌DH5a,BL21（DE3）pLysS

（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）,和BL21-CodonPlus-RIL（Stratagene公司，拉霍亚，CA）生长在37°C,BHI或Luria-Bertani中，需要时可向培养基中加红霉素（150》g/ml）,或氨苄青霉素（50》g/ml）或氯霉素（35》g/ml）。Table1OligonucleotidesusedinthisstudyM13Reverse CAGGAAACAGCTATGACT7PromoterSpdc5^XbalT7PromoterSpdc5^XbalSpdc3^XholSpdc5^ATGBamHISpdc3^KpnlSpdc301431Amj5^EcoRVAmj30XbaIGGCTTCTAGATAAAAAATGAATTGGAGGGCGGGCTCGAGATTAGTAGTTATTTTGGCCGGATCCATGAAAATAACAATTGCAGGCCGGTACCATTAGTAGTTATTTTGTCTGCTGCATATCCTGCAACCGATATCATTTTTGGTTGCCATTTGTTCCTCTAGACTAGACAACAAAATAG将胃八叠球菌（Spdc）克隆到pBluescript（原核表达载体）和pTRKH2（大肠杆菌穿梭质粒）使用Bactozol试剂盒（分子研究中心，俄亥俄州辛辛那提）从S.ventriculi中分离染色体DNA，按照制造商所描述的拟定方法，额外用氯仿抽提。PCR以S.ventriculi基因组DNA为模板，Spdc5CXbaI和Spdc30XhoI为引物（表1），从Genbank中获得其储存的序列AF354297并且这一序列引物的末端具有XbaIandXhoI位点。从基因组DNA中扩增出1.7kb的全长Spdc基因，然后进行纯化、消化，并且克隆到pBluescriptSK载体以及穿梭载体pTRKH2的XbaIandXhoI位点以获得pTRKH2Spdc重组子。Sambrook等将用到的标准的分子生物学技术进行了描述。用Qiaprep自旋试剂盒（Qiagen公司，瓦伦西亚，CA）进行大肠杆菌的质粒DNA的纯化制备。根据O'Sullivan和Klaenhammer，从植物乳杆菌菌株中分离质粒。如上所诉，完成DNA的测序和数据分析。在大肠杆菌中表达SpdcPCR引物Spdc5‘端的ATGBamHI酶切位点和Spdc3/端的Kpnl酶切位点用于扩增Spdc基因并且将其克隆到pRSETa（BamHI/KpnI）载体中。由此产生的pRSET-Spdc用来转化大肠杆菌BL21（DE3），pLysS，和BL21-CodonPlus-RIL。在体内，根据供应商指示进行了IPTG（异丙基-BD-半乳糖苷）诱导和表达。细胞颗粒的裂解使用CelLyticB+试剂盒（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）。约10》g可溶及不可溶的蛋白提取物（重悬于50》g磷酸盐缓冲液），进行12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了提高过量表达的蛋白质的溶解度，在10ml稀释的TB培养基中过夜培养，培养基中含有不同浓度（0,200,and500mM）的甘氨酸（Sigma公司），培养在37°C、OD=1的条件下。在0.5mMIPTG、27°C的600条件下进行14-16小时的蛋白质表达的诱导。在植物乳杆菌TF103中表达Spdc革兰氏阳性启动子--SPDC的融合构造如下。在pAK80中，以克隆质粒AMJ772,AMJ769和AMJ692所含有三个乳酸启动子作为模板扩增118bp的启动子序列，引物为Amj5‘EcoRV和Amj3‘Xbal位。这些启动子序列被克隆到pTRKH2Spdc的EcoRI/XbaI位点，分别生成pTRKH2772Spdc,pTRKH2769Spdc,和pTRKH2692Spdc。上述的这些结构通过电转化被转入到植入乳杆菌TF103，重组子通过红霉素筛选获得。丙酮酸脱羧酶检测如前所述，需进行丙酮酸脱羧酶（PDC）活性的检测。简言之，培养的含有SPDC融合基因的重组大肠杆菌和植物乳杆菌TF103细胞在含有2mM（毫摩）TPP和20mM（毫摩）硫酸镁的50mM磷酸钠缓冲液（pH值6.5）使用beadbeater研磨珠均质器（Biospec产品，巴特尔斯维尔，OK）进行溶解。使用BIORAD蛋白测定试剂盒（BIO-RAD实验室，大力士，CA）对蛋白浓度进行测定。将蛋白提取物（150-250》g/ml）加入到含有30mM（毫摩）乙醛，40mM（毫摩）甲醛，2mM（毫摩）TPP和20mM（毫摩）硫酸镁的50mM（毫摩）磷酸钠缓冲液（pH值6.5）中，定容至500》l,并在25C下培养30分钟。向反应混合物的上清中加入含0.2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（甲醇溶解）和10》l3M的氢氧化钠（最终130mM（毫摩））的四氮唑红20》l,然后进行（R）-PAC的检测。形成甲臜（大肠菌群在发育时伴随产生琥珀酸脱氢酶将纸片上的TTC（红四碳唑）还原成不可逆的甲®（Formazane）产生红色色素）的数量分光光度计在510nm处进行测定。1分钟1毫克蛋白质形成l》mol的甲臜即为具体的一个单位PDC活性。工程菌株TF103的发酵利用摇瓶发酵对产乙醇的重组植物乳杆菌TF103菌株进行评估。如上所诉，用加红霉素的4%葡萄糖MRS培养基进行重复发酵。发酵时间在72小时至240小时之间时，每隔一段时间取出一些样品。残余的葡萄糖和发酵产物，包括乳酸，醋酸和乙醇的浓度，利用高效液相色谱进行测定。通过两个实验获得的数据计算代谢产量（g乙醇/g葡萄糖），并且通过反复发酵分析其它发酵产物的产生。结果SPDC基因在大肠杆菌中的过量表达为了评估是否可以生产具有功能的PDC,将克隆出SPDC的ORF（开放可读框）亚克隆到具有组氨酸标记序列的大肠杆菌表达载体pRSETa中。通过SDS分析用IPTG诱导的带有pRSETa（表达载体）的大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIPL的细胞提取物（BL21-CodonPlus系列：包括BL21-CodonPlus*（DE3）-RIPL,BL21-CodonPlps-RIL，BL21-CodonPlps（DE3）-RIL,BL21-CodonPlps-RP,BL21CodonPlus*（DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L）,异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料），存在于不可溶组分的Spdc显示出明显的条带，与61kDa的多肽相对应。这一过量表达的SPDC的大小，符合所报道的在自然载体中58kDa加大约3kDa。SDS-PAGE结果表明，SPDC表达为不溶性聚合折叠中间物，也就是包涵体。为了诱导过量表达SPDC蛋白正确折叠，在带或不带IPTG诱导的培养基中加入甘氨酰和二肽。用分光光度计检测PDC酶的活性。如图3所示，经200毫摩甘氨酰、无IPTG诱导处理后细胞裂解液中可溶部分，PDC的活性最高。由此可见，对使用载体pRSETa表达的SPDC来说IPTG的处理是没有必要的。不溶性组分的酶活性尚未确定。将革兰氏阳性启动子-SPDC融合体引入TF103三个革兰氏阳性启动子，包括酸诱导的启动子p692、高表达的启动子p769,和相对中等强度启动子p772以及天然的Spdc5'端侧翼序列，与SPDC基因融合在宿主范围广泛的载体PTRKH2中。将这些ldhL和ldhD基因失活的结构中引入到植物乳杆菌TF103中。在通过分析从重组菌株分离出质粒的限制性内切酶发现，在TF103中有没有观察DNA重组的融合基因或pTRKH2（数据未显示）。之后，在测定TF103重组株PDC酶活性时发现，所有四个菌株都高于本底水平。在菌株中，PDC活性差异可能是由于在启动子序列的差异，由于菌株包含SPDC与酸诱导的启动子融合，pTRKH2-692-Spdc呈现出最高的PDC活性。正如之前报道，酸诱导启动子在pH值5.5比在pH7.0更活跃，在培养这些菌株pH值应介于4.20至5.80，在收获得时进行酶活性分析。重组株的发酵分析烧瓶发酵以研究工程菌产乙醇的能力。高效液相色谱分析发酵产品表明，携带Spdc基因所有四株生产的乙醇的量比仅被pTRKH2载体转化的对照菌株更大。菌株692-SPDC和769-SPDC显示出比其他测试菌株稍高的乙醇产量。然而，重组菌株也产生大量的乳酸。携带PTRKH2载体的对照菌生长速度非常缓慢，生产的主要醋酸（76毫摩），一些乳酸（60毫摩）和乙醇（17毫摩）。通过高效液相色谱法分析两个独立发酵实验的数据表明，乙醇代谢产量（克每克消耗糖生产乙醇）为消耗每克用葡萄糖产生0.15-0.28克乙醇。讨论代谢工程的一个主要目标是操纵生物系统使用适当的宿主实现所需工艺流程。在本研究中，革兰氏阳性的植物乳杆菌菌株作为宿主被引入革兰氏阳性PDC基因来增加乙醇的产量。以往的研究表明，PDC是以丙酮酸生产乙醇的关键酶，S.ventriculi的PDC基因中低含量的G+C做为一个合理的候选通过基因工程被引入到乳酸菌中。对于大多数乳酸菌，糖类（己糖和戊糖在某些情况下）是发酵的主要原料，丙酮酸是糖原料通过不同的途径形成的中央代谢产物。丙酮酸主要是通过乳酸脱氢酶的催化行动转化为乳酸。植物乳杆菌菌株在TF103包含需基因敲除的LDH（乳酸脱氢酶）基因。植物乳杆菌TF103的代谢分析表明，在丙酮酸的积累过程的同时，乳酸的量是否很低或检测不到，这取决于生长和发酵条件的好坏。因此，植物乳杆菌TF103被选定作为基因操纵的宿主菌，通过引入革兰氏阳性SPDC基因，努力引导丙酮酸进入乙醇发酵的途径。据预期估计，过量表达的S.ventriculi的PDC基因，在TF103中将中央代谢产物丙酮酸转化为乙醛，乙醛随后被一些内源性的乙醇脱氢酶催化成乙醇。在重组菌株中观察到不同的PDC酶活性的表明，每个启动子驱动TF103SPDC表达的强度是不同的。基于SPDC酶法的检测，看来，酸诱导启动子p692使得SPDC表达在TF103中最有效。进一步发酵分析结果表明，与转化了PTRKH2的对照菌株TF103（17毫米乙醇和乳酸60毫米）相比，重组菌株表现出较高的产乙醇量（90-130