第五章酶工程制药演示文稿

第五章酶工程制药演示文稿当前1页，总共95页。提酶及电泳当前2页，总共95页。酶在医药领域的应用（1）1、在疾病诊断方面的应用包括两个方面：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎；二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。2、在疾病治疗方面的应用种类很多，主要有：①蛋白酶，主要用于消化不良和食欲不振等；②溶菌酶，具有抗菌、消炎、镇痛等作用；③超氧化物歧化酶，具有抗辐射、抗氧化作用；④L-天冬酰胺酶，用于治疗白血病；⑤尿激酶，具有溶血栓的作用；⑥其他相关酶制剂，如细胞色素c等。当前3页，总共95页。酶在医药领域的应用（2）3、在药物生产方面的应用酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转化为药物。这方面的应用日益增多。如：利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素、利用β-酪氨酸酶制造多巴、利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷、利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。4、在分析检测方面的应用用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测是以酶的专一性为基础、以酶作用后物质的变化为依据来进行的。根据酶反应的不同，酶法检测可以分成单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等。当前4页，总共95页。第一节概述一、酶的特性酶(enzyme)是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。也称为生物催化剂。酶促反应：指反应物（或称底物）在酶的催化作用下所进行的反应。当前5页，总共95页。酶的一般特性：参与化学反应过程时能加快反应速度；降低反应的活化能；不改变反应性质即不改变反应的平衡点；反应前后其数量和性质不变。当前6页，总共95页。酶独自的特点：①催化效率高②专一性强③反应条件温和④催化活性受到调节和控制当前7页，总共95页。酶的分类：1961年国际生物化学联合会酶学委员会按酶所催化的反应类型将酶分成6大类：①氧化还原酶类；②转移酶类；③水解酶类；④裂合酶类；⑤异构酶类；⑥合成酶(或称连接酶)类。当前8页，总共95页。

二、酶工程简介酶工程（Enzymeengineering）是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。当前9页，总共95页。酶工程的历史在20世纪20年代初就出现了酶工程，在当时，主要是指自然酶制剂在工业上的大规模应用。酶的固定化技术诞生：1953年，Grubhoger和Schleith首先将羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等，用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定，提出了酶的固定化技术。1969年，日本学者首先应用固定化酶技术成功地拆分了DL-氨基酸。当前10页，总共95页。

1971年，第一届国际酶工程会议提出的酶工程的内容主要是：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等。随着科学的发展和酶技术研究的深入，酶的应用所涉及的面越来越广，在工业、农业、医药和食品等领域中应用都有广泛的应用。当前11页，总共95页。酶工程的内容①酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；②酶和细胞的固定化及酶反应器的研究(包括酶传感器、反应检测等)；③酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶(突变酶)的研究；④酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；⑤有机相中酶反应的研究；⑥酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究；⑦抗体酶、核酸酶的研究；⑧模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。当前12页，总共95页。第二节酶的来源和生产一、酶的来源早期酶的生产是以动物、植物为主要原料，如从猪颌下腺中提取激肽释放酶，从菠萝中制取菠萝蛋白酶，从木瓜汁液中制取木瓜蛋白酶等。但随着酶制剂应用范围的日益扩大，单纯依赖动植物来源的酶已不能满足要求，而且动、植物原料的生长周期长、来源有限、受地理、气候、季节等因素的影响，不适于大规模生产。动植物组织和细胞培养；微生物当前13页，总共95页。利用微生物生产酶制剂，突出的优点是：①微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都可以从微生物中得到。②微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量。③微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出高产菌株。当前14页，总共95页。二、酶的生产菌（1）⒈对菌种的要求作为酶制剂的生产菌应有特定的要求：①产酶量高，酶的性质应符合要求，而且是产生胞外酶的菌；②不是致病菌、系统发育上与病源体无关、不产生毒素；③稳定性好，不易变异、退化、感染噬菌体；④能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。当前15页，总共95页。二、酶的生产菌（2）⒉生产菌的来源

生产菌种可以从菌种保藏机构和有关研究部门获得，但大量的工作应该是从自然界中分离筛选。自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。筛选产酶菌的方法与其他发酵微生物的筛选方法基本一致。基因工程不断改良生产菌获得菌种当前16页，总共95页。二、酶的生产菌（3）⒊目前常用的产酶微生物大肠杆菌(E．coli)是应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶，需经细胞破碎才能分离得到。用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β—半乳糖苷酶等。当前17页，总共95页。二、酶的生产菌（4）枯草杆菌：主要用于发酵生产α-淀粉酶、β—葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。啤酒酵母：主要用于酿造啤酒、酒精、饮料和面包，生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。曲霉(黑曲霉和黄曲霉)：用于生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等用于生产相应的酶。当前18页，总共95页。第三节酶和细胞固定化酶反应几乎都是在水溶液中进行的，居于均相反应。均相酶反应系统中的游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量，另外溶液酶很不稳定，容易变性和失活。如果能将酶制剂制成既能保持其原有的催化活性、性能稳定、又不随水流动的固定化状态，即固定化酶(Immobilizedenzyme)，可大大提高酶的利用率。当前19页，总共95页。一、固定化酶的制备⒈固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶。是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，又能发挥催化作用的酶制剂。酶的固定化：通过载体等将酶限制或固定于特定的空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，又能发挥催化作用的酶制剂的过程。当前20页，总共95页。⒉固定化酶的特点酶类可大致分为天然酶和修饰酶，固定化酶属于修饰酶。固定化酶与天然酶相比，有下列优点：①可多次使用，活性不变②反应后，酶与底物和产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。③反应条件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。当前21页，总共95页。⒊酶和细胞固定化方法

酶和细胞固定化方法

载体结合法交联法包埋法

网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）当前22页，总共95页。⑴载体结合法载体结合法将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。①物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法。无机栽体：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化铝、硅胶、膨润土等；天然高分子载体：淀粉、谷蛋白等；大孔型合成树脂、陶瓷等载体近来也已被应用；此外具有疏水基的载体(丁基或己基-葡聚糖凝胶)，以及以单宁作为配基的纤维素衍生物等可作为载体。当前23页，总共95页。物理吸附法的优点、缺点理吸附法的优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，固定化与纯化可同时实现。酶失活后载体不变。缺点：最适吸附酶量无规律可循，不同载体和不同酶其吸附条件不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，同时酶与载体之间结合力不强，易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。当前24页，总共95页。②离子结合法：

离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。当前25页，总共95页。离子结合法的优缺点优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点：载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。当前26页，总共95页。③共价结合法共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，也就是将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。目前研究最广泛、内容最丰富的固定化方法，其原理是酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在载体上。当前27页，总共95页。共价结合法优缺点优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点：与离子结合法和物理吸附法相比，反应条件苛刻，操作复杂，而且采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活高的固定化酶，甚至酶的底物专一性会发生变化。当前28页，总共95页。⑵交联法交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间彼此连接成网络结构而使酶固定化的技术。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2，2’-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它可以不使用载体。当前29页，总共95页。交联法又可分为4种：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法、载体交联法。交联酶法：向酶溶液中加入多功能试剂，在一定的条件下形成固定化酶的技术。反应速度与酶浓度、试剂浓度、pH、离子强度、温度及反应时间有关。如0.2%木瓜蛋白酶和0.3%戊二醛在pH5.2~7.2，0℃，24h完成反应。酶与辅助蛋白交联法：在酶溶液中加入辅助蛋白的交联过程。辅助蛋白有：明胶、胶原、及动物血清白蛋白等。当前30页，总共95页。吸附交联法：是吸附与交联相结合的技术，其过程是先将酶吸附到载体上再与交联剂反应的方法。所得的固定化酶称为壳状固定化酶。此法兼备吸附与交联双重优点，即提高固定化酶机械强度又提高酶与载体结合能力，酶分布于载体表面与底物接触良好。载体交联法：同一多功能试剂分子部分化学集团与载体偶联而另一部分化学基团与酶分子偶联的方法。当前31页，总共95页。交联法的特点反应条件激烈，酶活回收较低。由于酶的功能团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性下降。改进办法：在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。当前32页，总共95页。最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联，其方式如下：当前33页，总共95页。⑶包埋法①网格型包埋法：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；②微囊化包埋法：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。③纤维包埋法：将可形成纤维的高聚物溶于与水不混溶的有机溶剂中，再与酶溶液混合与乳化，然后将乳化液经喷头挤入促凝剂（甲苯、石油醚）中形成纤维，可将酶纤维装成酶柱或织成酶布使用。当前34页，总共95页。包埋法的优缺点优点：一般不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。缺点：化学聚合反应包埋酶容易失活，因此必须合理设计反应条件。适用范围：小分子底物和产物的酶，不适合大分子底物和产物的酶。当前35页，总共95页。酶和细胞固定化模式当前36页，总共95页。⑷选择性热变性法此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。当前37页，总共95页。⒋酶和细胞的固定化载体对载体的要求:①固定化过程中不引起酶变性；②对酸碱有一定的耐受性；③有一定的机械强度；④有一定的亲水性及良好的稳定性；⑤有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；⑥共价结合时具有可活化基团；⑦有耐受酶和微生物细胞的能力；⑧廉价易得。当前38页，总共95页。⑴吸附载体吸附法有物理吸附和离子吸附两种：物理吸附所用的载体有无机物和有机物。当前39页，总共95页。⑵包埋载体:目前，工业上应用的包埋载体主要为卡拉胶、海藻胶等。⑶共价结合载体:

用共价结合法制备固定化酶或细胞所用的载体有纤维素、SephadexA200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。当前40页，总共95页。当前41页，总共95页。⒌固定化酶制备技术

⑴吸附法制备固定化酶技术离子交换吸附法是将解离状态的酶溶液与离子交换剂混合后，洗去未吸附的酶和杂质即得固定化酶。本方法中离子交换剂结合蛋白质能力较强。

影响载体吸附的因素:溶液的pH、离子强度、温度、蛋白质浓度及载体的比表面积等。

当前42页，总共95页。⑵包埋法制备固定化酶技术凝胶包埋法是将酶或细胞限制于高聚物网格中的技术；微囊化法是将酶或细胞定位于不同构型的膜外壳内的技术。纤维包埋法当前43页，总共95页。⑶交联法制备固定化酶技术交联酶法是向酶液中加人多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或分子间彼此连接成网络结构而形成固定化酶的技术。反应速度与酶的浓度、试剂的浓度、pH、离子强度、温度和反应时间有关。交联酶法

酶—辅助蛋白交联法吸附交联法载体交联法

当前44页，总共95页。⑷共价结合法制备固定化酶技术共价结合法是通过酶分子的非活性基团与载体表面的活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接法。共价结合法制备固定化酶的优点:酶与载体结合牢固，稳定性好。缺点:载体需要活化，固定化操作复杂，反应条件比较剧烈，酶容易失活和产生空间位阻效应。用于载体活化的方法有：日前用于载体活化的方法有酰基化、芳基化、烷基化及氨甲酰化等。当前45页，总共95页。

二、固定化细胞的制备⒈固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。细胞固定化技术是酶固定化技术的发展，因此固定化细胞也称为第二代固定化酶。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，它的应用比固定化酶更为普遍。已在医药、食品、化工、医疗诊断、农业、分析、环保、能源开发及理论研究中广泛应用。当前46页，总共95页。⒉固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能和固相催化剂特点。优点：①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③细胞内酶比固定化酶稳定性高④细胞内酶的附因子可自主再生⑤细胞本身含多酶体系，可催化一系列的反应⑥抗污染能力强当前47页，总共95页。⒊固定化细胞的制备技术固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法等。⑴载体结合法是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。当前48页，总共95页。

⑵包埋法将细胞定位于凝胶网格内的技术为包埋法。这是固定化细胞中应用最多的方法。常用的载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶及海藻胶等。

当前49页，总共95页。

⑶交联法用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。

⑷无载体法靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。当前50页，总共95页。三、固定化方法与载体的选择依据⒈固定化方法的选择⑴固定化酶应用的安全性尽管固定化生物催化剂比化学催化剂更为安全，但也需要按照药物和食品领域的检验标推作出必要的检查。⑵固定化酶在操作中的稳定性在选择固定化的方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。⑶固定化的成本固定化成本包括酶、载体和试剂的费用，也包括水、电、气、设备及劳务投资。当前51页，总共95页。⒉载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈纲碎屑等，也都是有应用前途的载体。载体的选择还应考虑底物的性质等因素。当前52页，总共95页。

固定化方法及其特性的比较当前53页，总共95页。四、固定化酶的形状与性质⒈固定化酶的形状⑴颗粒状固定化酶颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。⑵纤维状固定化酶某些材料，如三醋酸纤维素，用适当的溶剂溶解后与酶混合，再采用喷丝的方法就可制成酶纤维。当前54页，总共95页。⑶膜状固定化酶膜状固定化酶也称为酶膜，可以通过共价结合法将酶偶联到滤膜上制备，也可以将酶和某些材料如火棉胶、硝酸纤维素、骨胶原和明胶等，用戊二醛交联或其他方法处理后制成膜状。⑷管状固定化酶

管状固定化酶称为酶管，某些管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺等，经活化后与酶偶联即得固定化酶管。当前55页，总共95页。⒉固定化酶的性质天然酶经过固定化后即成为固定化酶，可能会导致酶学性质和酶活力的变化。⑴酶活力的变化酶经过固定化后活力大都下降，其原因主要是酶的活性中心的重要氨基酸与载体发生了结合，酶的空间结构发生了变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。当前56页，总共95页。⑵酶稳定性的变化固定化酶的稳定性包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。蛋白酶经过固定化后，限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，稳定性明显增加。①操作稳定性②贮藏稳定性③热稳定性④对蛋白酶的稳定性当前57页，总共95页。①操作稳定性操作稳定性是能否实际应用的关键因素。操作稳定性通常用半衰期表示，固定化酶的活力下降为初活力一半时所经历的连续操作时间称为半衰期。固定化酶稳定性的测定过程必须注明测定和处理条件，通常半哀期达到1个月以上时，具有工业应用价值。当前58页，总共95页。②贮藏稳定性酶经过固定化后最好立即投入使用，否则活力会逐渐降低。若需长期贮存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂等，并于低温下放置。③热稳定性热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。许多酶如乳酸脱氢酶和脲酶等，固定化后的热稳定性均比游离酶高。当前59页，总共95页。④对蛋白酶的稳定性大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力提高，可能由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶颗粒的内部。如用尼龙、聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶对蛋白酶极为稳定，而在同样条件下的游离酶几乎完全失活。因此，在工业生产中应用固定化酶是极为有利的。当前60页，总共95页。⑶酶学特性的变化①底物专一性：

酶经过固定化后，由于位阻效应，对高分子底物的活性明显下降。②最适pH：酶经固定化后，其反应的最适pH可能发生改变，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。需要调整料液的pH使固定化酶达到最大的催化速度。当前61页，总共95页。③最适温度：酶经过固定化后可能导致其空间结构更为稳定，大多数酶经固定化后，最适温度升高。④米氏常数（Km)：Km值是表示酶和底物亲和力大小的客观指标。天然酶经固定化后，其Km值均发生变化，底物不同增加的幅度不同。⑤最大反应速度（Vm)：大多数的天然酶经固定化后，其Vm与天然酶相同或接近，但固定化的方法不同也有差异，如多孔玻璃共价结合的转化酶，其Vm与天然酶相同，但用聚丙烯酰胺包埋的转化酶，Vm比天然酶小10％。当前62页，总共95页。五、固定化细胞的形状与性质⒈固定化细胞的形状由于细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，许多方法都相同，因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的形状相同，如珠状、块状、片状或纤维状等当前63页，总共95页。⒉固定化细胞的性质细胞被固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适pH、最适温度和Km值的变化基本上与固定化酶相仿。细胞的固定化主要是利用胞内酶，因此固定化的细胞主要用于催化小分子底物的反应，而不适于大分子底物。当前64页，总共95页。

六、评价固定化酶（细胞）的指标1、固定化酶活力的测定方法酶活力:在单位时间内单位体积中的底物减少量或产物增加量来表示。⒈分批测定法⒉连续测定法影响酶活力测定的因素较多，如测定环境、pH、温度、离子强度、酶浓度、激活剂、振荡和搅拌速度以及固定化酶的颗粒大小的变化等均影响酶活力的测定。当前65页，总共95页。2、偶联率及相对活力的测定方法影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活可用偶联率或相对活力来表示。固定化酶的活力回收率是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶（细胞）总活力的百分数。偶联率=（加入酶活力-上清液酶活力）/加入蛋白活力×100%活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%相对活力=固定化酶总活力/（加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力）×100%偶联率=1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；偶联率＜1时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率＞1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。当前66页，总共95页。第四节固定化酶和固定化

细胞的反应器一、反应器的类型和特点⒈间歇式搅拌罐反应器用于游离酶反应后随即放料。⒉连续流动搅拌罐反应器连续进料、连续出料当前67页，总共95页。⒊填充床反应器固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。底物以恒定流速通过反应床。⒋流化床反应器底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。当前68页，总共95页。⒌循环反应器部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。⒍连续流动搅拌罐-超滤膜反应器这是由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器。⒎其它反应器当前69页，总共95页。各种反应器的示意图a、间歇式搅拌罐；b、连续流动搅拌罐；c、b+超滤膜；d、填充床；e、循环；f、流化床当前70页，总共95页。

二、反应器的选择依据⒈根据固定化酶的形状⒉根据底物的物理性质⒊根据反应的动力学特性⒋根据外界环境对酶的稳定性的影响⒌根据操作要求及反应器费用当前71页，总共95页。第五节酶工程在医药工业中的应用

酶促反应的专一性强,反应条件温和。酶工程优点：工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好。还可制造出化学法无法生产的产品。当前72页，总共95页。1、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)技术路线

E.Coli斜面细胞固定化细胞青霉素G转化液滤液6-APA粗品2、固定化酶法生产5‘-复合单核苷酸3、固定化酶法生产L-氨基酸培养固定转化过滤抽提当前73页，总共95页。青霉素酰化酶转化流程图当前74页，总共95页。第六节酶工程研究的进展一、酶的化学修饰二、酶的人工模拟三、有机相的酶反应四、基因工程酶的构建当前75页，总共95页。一、酶的化学修饰⒈酶的化学修饰的目的和意义提高酶的稳定性、消除酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最适温度、KM值、催化活性和专一性等)、扩大酶的应用范围等研究越来越引起人们的重视。当前76页，总共95页。⒉常用的化学修饰剂⑴对化学修饰剂的要求一般情况下，要求修饰剂具有较大的相对分子质量，良好的生物相容性和水溶性，分子表面有较多的反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。⑵常用的化学修饰剂①糖及糖的衍生物：主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚搪凝胶、聚乳糖等。②高分子多聚物：主要是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇（PVA）、聚N—乙烯吡咯烷酮(PVP）等。③生物大分子：常用的有肝素、血浆蛋白质、聚氨基酸类等。④双功能试剂：主要有戊二醛、二异硫氰酸、二胺类等。⑤其他：常用的修饰剂还有某些固定化酶载体、糖基化试剂、甲基化试剂、乙基化试剂及某些小分子有机物等。当前77页，总共95页。⒊化学修饰的措施

酶的化学修饰方法有很多，但基本原则都是充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经过一定的活化过程与酶分子中的某些基团或辅因子产生化学反应．对酶分子结构进行改造。⑴修饰酶的功能基团⑵酶分子内或分子间进行交联⑶修饰酶的辅因子⑷酶与高分子化合物相结合当前78页，总共95页。⒋修饰酶的特性酶分子经过化学修饰后，其特性在一定程度上发生改变，天然酶的一些不足之处可以得到改善。⑴热稳定性提高⑵抗各类失活因子能力提高⑶抗原性消除当前79页，总共95页。⑷体内半衰期延长⑸最适pH改变⑹酶学性质变化Km，底物专一性⑺对组织分布能力改变α-葡萄糖苷酶经白蛋白修饰后，有利于肝细胞对其摄入，使更多的酶到达靶器官发挥作用。辣根过氧化物酶用聚赖氨酸修饰后，细胞的摄入量增加，对细胞的穿透能力能增加100倍。当前80页，总共95页。⒌酶的化学修饰的前景

化学修饰可以改变天然酶各种活性，扩大酶的应用范围。化学修饰法是改造酶分子的有效方法，而且已有了一定的规律性和普遍性，具有广泛的应用前景。当前81页，总共95页。二、酶的人工模拟根据酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物叫人工模拟酶(Enzymeofartificialimitation)，简称人工酶或模拟酶。1．模拟酶的分类（1）根据Kirby分类法，模拟酶可分为：①单纯酶模型，即以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。②机制酶模型，即通过对酶作用机制诸如识别、结合和过度态稳定化认识，来指导酶模型的设计和生产。③单纯合成的酶样化合物，即一些化学合成的具有催化活性的简单分子。当前82页，总共95页。（2）按照模拟酶的属性分类按照模拟酶的属性可分为：①主-客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等。②胶束模拟酶（模拟水解酶的胶束酶模型、辅酶的胶束酶模型、金属胶束酶模型）。③肽酶。模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。④半合成酶。以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。⑤分子印迹酶。当前83页，总共95页。主要的人工模拟酶介绍1．模拟酶—环糊精模拟酶工作研究较多的是环糊精(cyclodextrin)。它是一种优良的模拟酶，可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包接络合物，以此影响和催化一些反应。当前84页，总共95页。α-环糊精的分子结构当前85页，总共95页。2．分子印迹分子印迹(molecularimprinting)是指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子称为印迹分子或模板。制备过程：①选定印迹分子和功能单体，让它们之间发生互补作用，形成印迹—功能单体复合物；②用交联剂在印迹分子—功能单体复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物；③从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物(下图)。当前86页，