流式细胞术在白血病中的应用

关于流式细胞术在白血病中的应用第一页，共五十三页，编辑于2023年，星期二2世界卫生组织血液肿瘤分类方案（1999年）“新分类方案的基本原则是：结合形态学、免疫表型、遗传改变和临床特征来鉴定疾病的‘真实’本质”。“这为世界各国肿瘤学家和病理学家提供了一个全新的与令人兴奋的合作交流新篇章，必将极大促进人们对血液肿瘤的治疗与认识。”（美国临床肿瘤协会，临床肿瘤杂志17卷3835-3849页，1999年）更重要的是提供了疾病分类与治疗选择和预后判断的较明确关联性，开启了血液肿瘤靶向性治疗和个性化方案的新时代。第二页，共五十三页，编辑于2023年，星期二3白血病分子诊断的意义系统诊断白血病初发异常标记精确诊断准确预后指导治疗科研资料残留监测靶向治疗免疫/遗传学靶标MICM诊断第三页，共五十三页，编辑于2023年，星期二4WHO血液肿瘤新分类实验技术平台实施WHO血液肿瘤新分类方案高度依赖流式细胞、细胞遗传和分子生物学实验技术平台以及掌握这类实验技能并具有专业知识的人员。第四页，共五十三页，编辑于2023年，星期二5第五页，共五十三页，编辑于2023年，星期二6InvestigativeToolsforMMdiagnosisandManagement(2008ASHEducationProgramBookp298)

PatientEvaluation

诊断

单克隆蛋白数量和特征

血清蛋白电泳和免疫球蛋白定量 24小时尿蛋白；总蛋白；本周蛋白

尿和血清免疫固定

血清自由轻链和比例

骨髓检查和骨髓活检Bonemarrowaspirationandbiopsy

组化

免疫分型-克隆检定，及通过CD38/CD56/CD19/CD45抗体组合能从90余例患者正常浆细胞中找到检测残留MM细胞

终末器官损害评价

全血细胞计数；生化检查:血清肌酐和骨钙测定

预后评估

球蛋白，betta-2微球蛋白,LDH,CRP

骨髓细胞遗传学和FISHt(4;14),t(14;16),del17p

针对某些特定患者的特殊研究

第六页，共五十三页，编辑于2023年，星期二7传统流式细胞术的临床应用细胞计数：CD4、CD34DNA含量：多倍数、S期结果是数据、准确性依赖于良好的质控传统流式细胞术在白血病免疫表型中的应用单参“白血病表型”，阳性比率大多数细胞为肿瘤细胞多为形态学/细胞化学后的确认数据由临床医师判断高分辨流式细胞的优点以多参数正常抗原表达为基础结果类似病理报告用于原发性诊断与鉴别诊断用于疾病分期，治疗选择疗效监测，预后判断流式细胞术第七页，共五十三页，编辑于2023年，星期二8骨髓-异质性系统中的应用多系列Lymphocyte(T,B,NK)MonocyteNeutrophilEosinophilBasophilErythrocyte骨髓中各系列细胞处于连续性成熟阶段必须能涵盖所有细胞第八页，共五十三页，编辑于2023年，星期二9应该使用何种抗体？所有抗体必须为标准的商业化试剂没有什么“秘密武器”或者专门特异的抗体抗体的联合应用能使你从有限的标本中得到最大化的信息量对正常抗原表达的正确认识能帮助你有效地鉴别疾病状态相关的改变第九页，共五十三页，编辑于2023年，星期二10高分辨流式细胞术能够鉴别和分类所有骨髓细胞可以对每一个细胞进行多特征性的检测并对其相应的系列和成熟的阶段进行分类至少检测一万个细胞，分辨率达到0.5%第十页，共五十三页，编辑于2023年，星期二11第十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期二12CD45/SSWood(2004)MethodsCellBiology75:559-576第十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期二13正常粒系成熟模式第十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期二正常B系成熟Wood(2004)MethodsCellBiology75:559-576第十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期二15表达交叉系列的抗原非同步抗原共表达：CD34与CD15、CD11b、CD56、CD14抗原的过度表达：早前B-ALL中CD10抗原表达缺失：泛T抗原易位抗原表达：CSF中TdT+淋巴细胞，骨髓中胸腺发育阶段的T淋巴细胞光散射异常：FSC和SSC白血病相关的免疫表型特点第十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期二16AML-M0第十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期二17AML-M2第十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期二18AML-M3第十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期二19AML-M4第十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期二20AML-M5第二十页，共五十三页，编辑于2023年，星期二21B-ALL第二十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期二22Burkitt淋巴瘤/白血病

成熟B-ALL第二十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期二23MALT+GMALT+B第二十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期二24AUL第二十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期二25B-CLL/SLL第二十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期二26HCL第二十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期二27大B细胞淋巴瘤第二十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期二28MM第二十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期二29T-ALL第二十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期二30NK-LGL第三十页，共五十三页，编辑于2023年，星期二31报告包括出现或缺乏的异常细胞群异常免疫表型相比正常细胞群的抗原强度增强，减弱，缺失定量层面的判断相对于全部CD45阳性细胞(WBCs)出现的其它细胞群第三十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期二32第三十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期二33TCRVβ克隆第三十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期二34小结流式细胞术有助于血液系统异常疾病的诊断更加确定的诊断排除其他疾病有助于细分亚型更准确的原始细胞辨别和定量有助于预后判断治疗后监测快速第三十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期二35免疫表型分析与FAB分型基于不同的参数对白血病进行分型，两者的结果可一致或不一致；对有些病例，尤其是髓系白血病亚型，免疫表型分析并非特异；对于复杂的病例，需结合多种检查，如特异性染色体核型分析或融合基因综合判断。第三十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期二36MRD背景目前由于多种化疗药的联合应用，使多数白血病患者可以获得形态学的完全缓解（CR）。但多数患者不能维持长期缓解，仍有相当多的患者再次复发。复发的主要原因是患者体内存在少量的形态学难以辨认的残存白血病细胞。如果能够准确检测患者体内残存的白血病状态，可以有的放矢地进行治疗，使患者避免许多不必要的痛苦。第三十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期二37MRDOutlineofLeukemicDiagnosisMorphology:1-5%,Cytogenetics:1-5%,Flowcytometry:0.1-0.01%,RT-PCR:0.01-0.001%CRPrimaryleukemiaOSChemotherapiesAutoSCTAlloSCTInductionLeukemiccells1012 1010109108107≤106100% 1% 0.1%0.010.001 第三十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期二38第三十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期二39MolecularMeasurementsofTreatmentResponse—ClinicalApplication(2008ASHEducationProgramBookp367)

Application Action

检测治疗早期的反应佳 加强治疗检测治疗早期的反应差

无需加强治疗

检测复发 加强治疗，准备HSCT

HSCT前MRD评估 优化HSCT的时间HSCT后MRD评估 调整免疫抑制治疗时间，等

临床试验结束时的MRD评估 评价新的抗ALL药物或治疗的结果

第三十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期二40MRD与预后当残存白血病细胞>10-2，3年复发率为76-94%10-3<残存白血病细胞<10-2,3年复发率为37-53%残存白血病细胞<10-3,3年复发率为8-20%残存白血病细胞<10-4,3年无复发第四十页，共五十三页，编辑于2023年，星期二41各种MRD检测方法检测残存白血病细胞的主要依据是在患者发病时找到患者的特殊表现，包括遗传学、分子生物学以及免疫学的特征。这些特征往往是正常血细胞所没有的，因此可利用这些标志鉴别正常细胞与异常细胞，特异地检测残存白血病细胞。评价这些方法的有效性及应用性主要依据该方法的特异性、敏感性、简单性、重复性和速度。FCM免疫表型、FCMDNA倍体、PCR、FISH是较好的方法。第四十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期二42MRD流式分析原则违背正常分化模式诊断时辨别出背离正常发育阶段的免疫表型相对特异的抗原组合随访辨别出不同于正常免疫表型的不连续群体以诊断的免疫表型作为出发点第四十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期二43免疫表型异常适合MRD检测ALL>95%儿童ALL>90-95%成人ALLAML85%儿童AML80-95%成人AML第四十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期二44报告模板第四十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期二45病例一AML病例资料：女，3岁，2009.6初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，原始细胞分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的26%，主要表达HLA-DR、CD13、CD15、CD33、CD34、CD38、CD117，（CD19+2.27%）。淋巴细胞比例降低。提示：急性髓系细胞白血病（AML-M2可能）。基因：AML1/ETO阳性。第四十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期二46病例一（续1）2009.7化疗D33：FCM：可见残留，CD33+CD19+细胞约占0.04%。基因：AML1/ETO阳性。第四十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期二472009.9D70：FCM：未做。基因：AML1/ETO阴性。2010.3D245：FCM：未见免疫表型明显异常的细胞。基因：AML1/ETO阴性。病例一（续2）第四十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期二48病例二B-ALL病例资料：男，3岁，2007.3初发FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，CD45弱表达分布区域可见异常细胞群体，约占有核细胞的45%，表达HLA-DR、CD10、CD19、CD22、CD34、CD38、Gly-A、cCD79a、TdT。提示：急性B淋巴细胞白血病（普通型B-ALL）。基因：BCR/ABL阴性。第四十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期二492008.11化疗第20个月：FCM：未见明显表型异常的残留白血病细胞。（未附图）基因：未做。2009.09化疗第30个月：FCM：可见残留，在CD45dim/-区域可见约1.87%的CD10+CD19+CD20-细胞和约1.55%的HLA-DR+CD19+CD34+细胞，考虑为残留白血病细胞。（见右图）基因：未做。病例二（续1）第四十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期二50病例二（续2）2010.03化疗+DC-CIK第36个月：FCM印象：在CD45/SSC点图上设门分析，CD45阴性略向原始延伸的分布区域可见异常细胞群体，与有核