可用于实时荧光定量PCR标准化的白桦内参基因-(完整版)实用资料

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收稿2021-05-13修定2021-07-30可用于实时荧光定量PCR标准化的白桦内参基因（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）资助黑龙江省自然基金重点项目(ZD202118和中央高校基本科研业务费专项资金(DL09BA14。*通讯作者(E-mail:yaguangzhan@126;Tel:0451-********。可用于实时荧光定量PCR标准化的白桦内参基因尹静1,任春林1,詹亚光1,*,滕文华2,陈秀福1,王玉成3,孙红冉1东北林业大学1生命学院;2帽儿山实验林场,3林学院,哈尔滨150040提要:为了快速、准确的对白桦多个样品进行基因表达分析,本研究应用荧光定量PCR技术,对白桦持家基因微管蛋白基因(Tu和泛素基因(UbQ在不同处理的细胞及不同树龄或不同生长季节白桦植株各部位表达的稳定性进行检测。结果表明,对于茉莉酸甲酯(MeJA、水杨酸(SA处理的白桦细胞和不同生长季节白桦植株的基因定量表达分析,可同时使用Tu和UbQ平衡化qRT-PCR数据;而针对不同树龄白桦茎皮中基因表达研究时,单独使用UbQ基因作为内参对照即可获得精确的表达数据。关键词:白桦;实时定量PCR;持家基因SelectionofInternalControlGenesforReal-TimeRT-PCRNormalizationinWhiteBirch(BetulaplatyphyllaSuk.YINJing1,RENChun-Lin1,ZHANYa-Guang1,*,TENGWen-Hua2,CHENXiu-Fu1,WANGYu-Cheng3,SUNHong-Ran11CollegeofLifeSciences,2MaoershanExperimentalForestryCenter,3CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,ChinaAbstract:Inordertofacilitaterapidandaccurategeneexpressionanalysisofmultiplesamplesfrombirch,theexpressionstabilityofhousekeepinggenessuchasgenescodingmicro-tubeprotein(Tuandubiquitin(UbQwereassessedbyqRT-PCRusingasetofcDNAsfromdifferentbirchsamplesincludingcellsafterdifferenttreatmentsanddifferentpartsofbirchplantsindifferentagesordifferentgrowingseasons.Theresultssug-gestedthattheTuandUbQgenescouldprovidedsuperiortranscriptnormalizationinbirchcellstreatedwithdifferentelicitors(MeJAandSA,andbirchplantsindifferentgrowingseasons,whileUbQgenewastherecommendedreferencegeneforgeneexpressionstudiesusingcDNAsfromwhitebirchbarkindefferentyears.Keywords:birch;real-timeRT-PCR;housekeepinggene实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR因为快速、灵敏和定量的特点,已经成为分析基因转录水平及进行芯片和微点阵数据验证的常用手段,这种方法比传统的Northern杂交更安全和精确,并且所需起始材料的量较少。但是实验过程会因为RNA的质量和数量、cDNA合成效率以及PCR扩增的差异而导致结果严重偏差(Vandesompele等2002。为了得到更精确的数据,通常需要一个和多个内对照基因来平衡化qRT-PCR数据。目前一般选择持家基因(housekeepinggene作为内对照,持家基因编码的蛋白是维持细胞结构和基本代谢所必需,所以其表达水平在各种环境下基本保持一致。持家基因包括泛素(ubiquitin,UbQ、肌动蛋白(actin、微管蛋白(tubulin,Tu、组蛋白(histone、18SrRNA以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH等基因。然而,很多持家基因的表达水平随着环境的改变和组织部位的不同而发生变化(Thellin等1999;Lee等2002;Czechowski等2005,如肌动蛋白基因是葡萄浆果发育过程中最稳定的内对照基因之一(Reid等2006,但在某些实验中肌动蛋白则表现不稳定(涂礼莉等2007。Nicot等(2005研究表明,在马铃薯应对生物胁迫(晚疫病和非生物胁迫(冷和盐害过程中,内参基因选择因处理不同而差异显著。因此,选择合适的持家基因作为qRT-PCR内参非常必要。白桦的树叶和树皮中富含三萜类化合物,药用价值广泛,加之其生长迅速,材质优良,是重要的经济树种。本实验以白桦细胞和白桦植株为试材,对持家基因UbQ和Tu在白桦细胞悬浮培养过程及白桦植株不同组织表达水平的稳定性进行了检测,以期为白桦中重要基因的定量表达研究提供更为准确的数据。材料与方法1实验材料1.1白桦细胞来源及处理白桦(BetulaplatyphyllaSuk.母树取自本校白桦强化种子园,5~7年生嫁接优树(接穗30年生诱导的组培苗。以白桦组培苗茎段为外植体,NT为基本培养基,附加激素0.01mg·L-1TDZ和0.1mg·L-1BA,诱导愈伤组织。稳定继代3次后,取3g(FW愈伤组织转移到含有100mL相同液体培养基的250mL三角瓶。悬浮培养第7天进行水杨酸(SA诱导处理,同时设立对照组(等量的0.5%乙醇水溶液。SA的终浓度为50mg·L-1,处理后0h、2h、12h、1d、3d、5d和7d分别收获细胞。处理重复3次,每次均按如上取样。细胞于液氮速冻,-80℃保存,待提取RNA。以白桦无菌苗茎段为外植体,IS为基本培养基,附加激素0.8mg·L-16-BA和0.6mg·L-1NAA诱导愈伤组织,稳定继代3次后,取3g(FW愈伤组织转移到250mL三角瓶中进行悬浮培养,其中含有100mLB5液体培养基,添加激素0.2mg·L-16-BA和0.6mg·L-1TDZ,然后在悬浮培养的第7天分别进行10µmol·L-1和100µmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA及500µmol·L-1布洛芬(IBU,即MeJA合成专一性抑制剂3种处理,同时设立对照组(0.5%乙醇水溶液,每种处理重复3次。MeJA和IBU处理后0h、6h、12h、1d、2d和3d分别收获细胞。细胞于液氮速冻,-80℃保存,待提取RNA。NT和B5液体培养基均添加20g·L-1蔗糖、pH值为6.0~6.5,以121℃高压蒸汽灭菌20min,培养温度为23℃~26℃,光照强度为40µmol·m-2·s-1,光照时间为16h·d-1,湿度为65%左右,摇床转速为120r·min-1。1.2白桦植株来源及取样不同树龄(一年生、四年生、六年生、八年生白桦植株来自东北林业大学白桦强化种子园,除一年生白桦苗在2021年5月~10月期间每月取样外,其余树龄均于6月中旬一次取样。样品包括不同树龄叶片、根皮和茎皮部分。液氮速冻后,-80℃冰箱保存,待提取RNA。2实验方法2.1RNA抽提及cDNA合成RNA提取采用Tris-CTAB法,不同样品总RNA用DNaseI(Promega处理,RNA完整性通过1.4%(W/V琼脂糖胶电泳检测。用EppendorfDU800分光光度计(EppendorfAG分析核酸浓度。取A260/A280在1.9~2.1之间及A260/A230大于2.0的RNA进行cDNA合成。cDNA的合成操作参照TaKaRaPrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit说明书,以500ng总RNA为起始材料,合成cDNA第一链。反应结束后,加180µL去离子水稀释,于-20℃保存备用。2.2实时荧光定量PCR反应体系及程序选择白桦微管蛋白基因(alpha-tubulin,Tu,GenBank号为FG067376和泛素基因(Ubiquitin,UbQ,GenBank号为FG0656182个持家基因,根据已知基因序列,同时依据real-timeRT-PCR引物设计原则,利用PrimerPremier5.0软件进行引物设计。引物序列见表1。表1实时荧光定量PCR使用的持家基因引物序列Table1Primersforquantitativereal-timePCR基因5'→3'UbQ(RGATTGAGGGGAGGGATGCTGUbQ(LGGAGGACAAGGTGGAGGGTGTu(RTCAACCGCCTTGTCTCTCAGGTu(LTGGCTCGAATGCACTGTTGG实时荧光定量PCR所用试剂盒为TOYOBO公司(日本生产的SYBRGreenRealtimePCRMasterMix-Plus-(codeNo.QPK-212T。PCR反应体系含有3.1µL蒸馏水、10µLSYBRGreenRealtimePCRMasterMix-Plus-,2µLPlussolution、1.2µL引物R(10µmol·L-1、1.2µL引物L(10µmol·L-1、2.5µL稀释的cDNA模板。所有试验样品均重复3次。PCR反应在OPTIONII(MJResearch公司荧光定量PCR仪上完成。PCR反应程序为:94℃预变性30s;94℃变性12s;58℃退火30s;72℃延伸40s;82℃,1s;读板。45次循环。每0.5℃进行熔解曲线(meltingcurve扫描,温度范围55~99℃。结果与讨论1SA处理下白桦细胞中持家基因表达变化设定0.01为荧光定量PCR的阈值,Tu和UbQ这2个持家基因的熔解曲线均为单一峰值,熔解温度分别为84℃和86℃,确定产物单一。结合PCR测序结果,与已知白桦基因Tu和UbQ序列同源性达99%,1个碱基的差异可能是荧光产物测序过程中造成的误差。图1水杨酸(50mg·L-1处理的白桦细胞中持家基因Tu和UbQ的Ct检测值Fig.1TheCtvalueofhousekeepinggenesTuandUbQinbirchcellstreatedwith50mg·L-1salicylicacid表2不同处理下白桦细胞及白桦植株各部位中持家基因Ct值变异系数Table2ThecoefficientofvariationofCtvalueofhousekeepinggeneindifferentcellsunderdifferenttreatmentsandindifferentpartsofbirchtrees材料持家基因最大值最小值平均值标准差(SD变异系数(CVMeJA处理白桦细胞25.20320.12522.4772.1170.094图2茉莉酸甲酯及其抑制剂IBU处理的白桦细胞中持家基因Tu和UbQ的Ct值检测Fig.2TheCtvalueofhousekeepinggenesTuandUbQofbirchcellstreatedwithMeJAandIBU0h:处理前;6hIBU:500µmol·L-1IBU处理6h;12hIBU:500µmol·L-1IBU处理12h;1dIBU:500µmol·L-1IBU处理1d;2dIBU:500µmol·L-1IBU处理2d;3dIBU:500µmol·L-1IBU处理3d;6hMeJA/10:10µmol·L-1MeJA处理6h;12hMeJA/10:10µmol·L-1MeJA处理12h;1dMeJA/10:10µmol·L-1MeJA处理1d;2dMeJA/10:10µmol·L-1MeJA处理2d;3dMeJA/10:10µmol·L-1MeJA处理3d;6hMeJA/100:100µmol·L-1MeJA处理6h;12hMeJA/100:100µmol·L-1MeJA处理12h;1dMeJA/100:100µmol·L-1MeJA处理1d;2dMeJA/100:100µmol·L-1MeJA处理2d;3dMeJA/100:100µmol·L-1MeJA处理3d。2MeJA处理的白桦细胞中持家基因表达变化由图2表明,经过IS培养基诱导愈伤组织,再在B5培养基中进行悬浮培养的白桦细胞,在培养中期(第7天加入不同浓度(10µmol·L-1和100µmol·L-1MeJA或MeJA合成的专一性抑制剂IBU(500µmol·L-1后不同时间取样,结果表明,Tu基因在10µmol·L-1和100µmol·L-1MeJA分别处理12h及IBU处理1d时,Ct值极显著高于其他处理;UbQ基因在各处理间表图3一年生白桦植株不同部位持家基因Tu和UbQ的Ct值变化Fig.3TheCtvalueofhousekeepinggenesTuandUbQindifferenttissuesofwhitebirch达变化很小,且以Tu+UbQ同时使用时变异系数最低,可以明确同时使用这2个持家基因组合作为MeJA及其抑制剂IBU处理的白桦细胞基因定量表达的内参对照效果最佳。3白桦植株中持家基因表达变化在整个生长季节(哈尔滨6~10月期间,一年生白桦植株中根皮、叶片和茎皮中持家基因Tu和UbQ的表达略有变化,如Tu基因在6月、7月茎皮及8月根中表达量较高(Ct值低于其他处理外,其他处理间相对稳定;UbQ基因在6月叶、根,7月和10月叶中,Ct值较高;而Tu+UbQ基因Ct值在6对不同树龄白桦茎皮中持家基因Tu和UbQ的Ct值检测结果表明,一年生、四年生、六年生和八年生的白桦茎皮中Tu基因及Tu+UbQ基因Ct值乳制品生产企业安全生产标准化评定标准考评说明1.本评定标准适用于乳制品生产企业。2.本评定标准共13项考评类目、47项考评项目和153条考评内容。3.在本评定标准的“自评/评审描述”列中,企业及评审单位应根据“考评内容”和“考评办法”的有关要求,针对企业实际情况,如实进行扣分点说明、描述,并在《自评扣分点及原因说明汇总表》(见附表中逐条列出。4.本评定标准中累计扣分的,直到该考评内容分数扣完为止,不得出现负分。有需要追加扣分的,在该考评类目内进行扣分,也不得出现负分。5.本评定标准共计1000分。最终评审评分换算成百分制,换算公式如下:最后得分采用四舍五入,取小数点后一位数。6.标准化等级分为一级、二级和三级,一级为最高。评定所对应的等级须同时满足评审评分和安全绩效等要求,取最低的等级来确定标准化等级(见下表。—1—乳制品生产企业安全生产标准化评定标准自评/评审单位:自评/评审时间:从年月日到年月日自评/评审组组长:自评/评审组主要成员:—2——3——4——5—冶金企业安全生产标准化评定标准(炼钢考评说明1.本评定标准所指的炼钢企业包括钢铁联合企业中的炼钢单元及独立炼钢生产企业,适用于炼钢企业开展安全生产标准化自评、申请、外部评审及各级安全监管部门监督审核等相关工作。2.在考核年度内未发生较大及以上生产安全事故、依法生产的炼钢企业,可以参加安全生产标准化等级考评。3.本评定标准分为13项考评类目、47项考评项目和211条考评内容。4.在评定标准表中的自评/评审描述列中,企业及评审单位应根据评定标准的有关要求,针对企业实际情况,如实进行得分及扣分点说明、描述,并在自评扣分点及原因说明汇总表(见附表中逐条列出。5.本评定标准中累计扣分的,均为直到该考评内容分数扣完为止,不出现负分。有特别说明扣分的(在考评办法中加粗的内容,应在该类目内进行扣分。6.本评定标准共计650分,最终标准化得分换算成百分制。换算公式如下:标准化得分(百分制=标准化工作评定得分÷(650-不参与考评内容分数之和×100。最后得分采用四舍五入,取小数点后一位数。7.标准化等级共分为一级、二级、三级,其中一级为最高。评定所对应的等级应同时满足标准化得分和安全绩效要求,取其中较低的等级确定最后标准化等级(见下表。8.炼钢企业安全生产标准化考评程序、有效期、等级证书和牌匾等按照《全国冶金等工贸企业安全生产标准化考评办法》(安监总管四〔2021〕84号中的有关要求执行。2021年1月31日国家安全监管总局印发的《冶金企业安全标准化炼钢单元考评标准》(安监总管一〔2021〕23号同时废止。冶金企业安全生产标准化评定标准(炼钢自评/评审单位:自评/评审时间:从年月日到年月日自评/评审组组长:自评/评审组主要成员:—37——38——39—考评类目考评标准考评内容项目分值13.1绩效应建立安全标准化绩效评定的管评定理制度，明确组织、时间、人员、内容2范围、方法与技术、过程、报告与分析等要求。通过评估与分析，发现安全管理过程中的责任履行、系统运行、检查监控、隐患整改、考评考核等方面存在的问2题，由安全生产委员会或安全领导机构讨论提出纠正、预防的管理方案，并纳入下一周期的安全工作实施计划中。应每年至少一次对安全生产标准化实施情况进行评定，并形成正式的评定报告。发生死亡事故后，应重新进行评定。2评分标准无该项制度的，不得分；制度中每缺少一项要求的，扣1分；制度缺乏操作性和针对性的，扣1分。未进行讨论且未形成会议纪要的，不得分；纠正、预防的管理方案，未纳入下一周期实施计划的，扣1