RNAi及其在抗HIV中的初步应用

RNAi及其在抗HIV中的初步应用第1页/共93页第2页/共93页RNAi的发现转录后基因沉默(posttranscriptional

gene

silencing，PTGS)在对牵牛花进行研究时发现，将色素合成基因置于一个强启动子后，导入牵牛花中，试图加深花朵的紫颜色，结果是不仅转入的基因未表达，而且自身色素合成也减弱了.

当时将这种现象称为转录后基因沉默(posttranscriptional

gene

silencing，PTGS)或“共抑制”(co-suppression).

第3页/共93页起初，认为PTGS这是少数几种植物中的特殊现象。转基因导致的基因沉默PTGS广泛存在于植物、真菌、动物中.

转基因沉默并非偶然现象，而是普遍存在的一种基因调控机制.第4页/共93页

郭苏（美国康乃尔大学Cornell复旦留美学生）1995年，用反义RNA阻遏华丽新小杆线虫(caenorhabditis

elegans)

par-1基因的表达以探讨该基因的功能。结果反义RNA确能阻断par-1基因的表达。但奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，同样也阻断了该基因的表达

第5页/共93页

Guo

S,

Kemphues

KJ.

par-1,

a

gene

required

for

establishing

polarity

in

C.

Elegans

embryos,

encodes

a

putative

Ser/Thr

kinase

that

is

asymmetrically

distributed.

Cell

1995;81:611-620

第6页/共93页AndyFire〔美国卡内矶研究所Carnegie）1998年首次将正义链和负义链的双链RNA(dsRNA)注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或负义链都强得多的基因沉默.

实际上每个细胞只需少数几个dsRNA分子就能完全阻断同源基因的表达.

注入双链RNA不仅可以高效阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其下一代同源基因的沉默，Fire将这种现象称为RNAi.

第7页/共93页Fire

A,

Xu

S,

Montgomery

MK,

Kostas

SA,

Driver

SE,

Mello

CC.

Potent

and

specific

genetic

interference

by

double-stranded

RNA

in

Caenorhabditis

elegans.

Nature

1998;391:806-811

第8页/共93页RNAi代表了一种的PTGS通路RNAi

现象已经在很多生物体中被发现比如植物、真菌、果蝇及包括小鼠在内的脊椎动物.

目前，认为是生物界广泛存在的转录后调控的形式。

针对基因功能研究中的敲除技术，科学家将RNAi称为对靶基因的“knockdown”，这是一个在后基因组研究中可与“knockout”相媲美的技术.

2001年，RNAi技术被成功地引入到哺乳动物细胞基因功能的研究中，

第9页/共93页RNAiandSiRNARNAi

：(RNA

interference)RNA干扰SiRNA：(smallinterferingRNAs）小分子干扰RNA片段将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默（PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）第10页/共93页RNAi的作用机制

RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititationandeffectorsteps)。在起始阶段:加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段SiRNAs。一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。第11页/共93页在RNAi效应阶段:siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。第12页/共93页processingthedsRNAinto21-23ntfragments3427212016short-interferingRNAstepone:第13页/共93页

DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNA第14页/共93页siRNAshaveadefinedstructure19ntduplex2nt3’overhangs第15页/共93页theantisensestrandofthesiRNAguidescleavagesteptwo:第16页/共93页RNAimechanismRNaseIIIlikeenzyme第17页/共93页RNAi高效性siRNA可作为一种特殊引物，在RNA依赖的RNA聚合酶RdRP的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA，又进入上述循环,新生成的dsRNA反复合成和降解，不断产生新的siRNA,从而使靶mRNA,渐进性减少，呈现基因沉默现象.(flash)第18页/共93页第19页/共93页PTGS有着古老的根源从遗传和生化的角度分别进行的研究同样指出转录后基因沉默（PTGS）可能在生命进化的早期就存在。有人提出转录后基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子或RNA病毒的防御机制，可能在植物和动物分化之前就已经出现（一国两制现象）miRNA;长dsRNA第20页/共93页stRNA(smalltemporalRNAs,)

小短暂RNA一组小分子RNA，就是smalltemporalRNAs(stRNAs)，可以通过对特定目标转录本的翻译抑制来调控线虫的发育时钟1993年,Lee等在秀丽线虫上发现了第一个能时序调控胚胎后期发育的基因lin-42000年,Reinhart等再次在C.elegans中发现了第二个异时性开关基因let-7研究结果表明：线虫lin-4和let-7stRNAs是由那些大约70个碱基的转录产物折叠成茎环节构后形成的。折叠的RNA分子被Dicer酶（在线虫中称为DCR-1）切割成为22个碱基的stRNAs，第21页/共93页第22页/共93页InhibitionoftranslationImperfectmatchBlocktranslationNear-perfectmatchDegrademRNA第23页/共93页miRNA(microRNAs)小分子RNAstRNA是研究miRNA的起始点随后，在果蝇、线虫和Hela细胞中有大约100个新的大约22个碱基的小分子RNA——microRNAs(miRNAs)被鉴定出来目前，现已发现miRNA广泛存在于许多真核模式生物和细胞中,属于非蛋白编码RNAmiRNA和siRNA都是体内的小RNA基因,它们有许多相似之处并在生命活动中发挥了重要的调控作用第24页/共93页miRNA的特点miRNA一般来源于染色体非编码蛋白区,本身不具有开放阅读框(ORF)成熟的miRNA长度通常是21~25nt,其5’端有一磷酸基团,3’端为羟基,但在3’端可以有1~2个碱基的长度变化.miRNA能够通过碱基互补配对结合于基因序列的侧翼区域多数miRNA在进化上高度保守,各种miRNA都能在其他种系中找到同源体.（最为显著的例子就是在昆虫和哺乳动物hnRNP基因的内含子中都发现mir-7的存在）第25页/共93页miRNA的特点miRNA表达具有细胞特异性和组织特异性.大多数miRNA的表达具有时序性第26页/共93页miRNA的功能miRNA的主要功能很可能是进行转录后调控目前已经知道miRNA的功能多与发育的时序调控有关,但也参与了空间发育,应激性,细胞周期和基因重组等过程(McManusetal.,2002).某些miRNA与RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)相关,能导致靶mRNA的裂解,产生基因沉默第27页/共93页miRNA的功能另外,miRNA还很可能与人类的某些疾病也有关联.在慢性淋巴细胞白血病病人中发现miR15和miR16这两个基因的表达有缺失或下调现象.这说明了miRNA很可能与人类肿瘤有关(Calinetal.,2002).最近研究还发现,miRNA还参与果蝇中的脂肪代谢(Xuetal.,2003)、在植物中控制叶和花的发育、以及在哺乳动物中造血细胞的分化(Chenetal.,2004)(细胞因子，网络调节问题）第28页/共93页miRNA的作用机制miRNA与siRNA的作用机制类似动物miRNA作用机制翻译抑制先由长的内源性转录本生成60-70nt的miRNA前体(pre-miRNA),pre-miRNA是长约70nt的非编码的RNA,它由内源性基因的DNA反向重复序列转录而来并且具有茎-环结构（miRNA是pre-miRNA茎中的一个臂,可定位于5’端的臂或3’端的臂）Dicer的作用形成单链的miRNA被PPD蛋白家族成员识别结合,形成一个RNA-蛋白复合体,即miRNP(类似于RISC)第29页/共93页以反义RNA的形式与靶基因3’端非翻译区(UTR)的特殊位点结合抑制其翻译从而调控基因的表达**动物miRNA一般通过对靶基因的不完全配对从而抑制靶基因的翻译,但是并不引起靶基因的降解植物miRNA的作用机制—切割降解第30页/共93页第31页/共93页miRNA和siRNA的区别与联系项目miRNAsiRNA来源内源转录本转基因或病毒RNA前体发夹结构的pre-miRNA双链结构的dsRNA作用酶Dicer或DicerlikeproteinsrDicer作用方式不完全互补或完全互补完全互补第32页/共93页miRNA和siRNA的区别与联系作用特异性相对较低高作用部位蛋白质合成水平转录后水平长度~22nt~22nt功能发育过程中,调节内源基因的表达抑制转录子活性和病毒感染.另还与表型遗传有关第33页/共93页第34页/共93页由长dsRNA引起的非特异基因沉默在各种生物中（植物、原生动物、昆虫、线虫）中陆续发现了自然存在的RNAi现象哺乳动物细胞中存在RNAi的证据则费了一番功夫才找到将较长的双链RNA(超过30个碱基对)转染哺乳动物细胞会引起非特异的基因表达抑制这和在其他生物中的特异抑制不同，这种抑制可能基于一种抗病毒应答反应，是通过以下两种途径之一进行的第35页/共93页长的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化使翻译起始因子eIF2a失活，导致翻译抑制长dsRNAs激活RNaseL，导致非特异的RNA降解第36页/共93页在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选/business/products/order2.htm/techlib/misc/siRNA_finder.html/Stu/shilin/rnai.html/rnadesign/default.aspx?SID=45358710第37页/共93页RNAi目标序列的选取原则(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

第38页/共93页RNAi目标序列的选取原则(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（/BLAST/）(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。第39页/共93页第40页/共93页第41页/共93页阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。第42页/共93页目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published第43页/共93页siRNA的制备通过化学合成体外转录长片断dsRNAs经RNaseIII类降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)体外制备siRNA通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。第44页/共93页1.化学合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素第45页/共93页2.体外转录

以DNAOligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。优点：体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。

第46页/共93页最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。第47页/共93页3.用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。第48页/共93页主要优点：可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAseIII通常比用Dicer要便宜）。缺点：有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。第49页/共93页最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗第50页/共93页体内表达采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。第51页/共93页4.siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。第52页/共93页要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的第53页/共93页siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。

病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。第54页/共93页最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。第55页/共93页第56页/共93页5.SiRNA表达框架SiRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNApolIII启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNApolIII终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。第57页/共93页SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。第58页/共93页主要缺点：①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。第59页/共93页最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子

不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）第60页/共93页

比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框材料需求

21-merRNA

oligos(一对)29-merDNAoligos(一对)转录模版(200-1000bp，两侧带T7启动子)55-60-merDNAoligos(一对)

~50-merDNAoligos(一对)全部制备/合成时间所需时间4天—2周24小时+DNAoligo合成时间1天+转录模版制备时间5天以上+DNAoligo合成时间~6小时+DNAoligo合成时间个人所需操作时间几乎不需要*中等中等多中等是否需要验证和寻找最有效siRNA需要需要不需要需要需要能否标记能能能不能不能

比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框材料需求

21-merRNA

oligos(一对)29-merDNAoligos(一对)转录模版(200-1000bp，两侧带T7启动子)55-60-merDNAoligos(一对)

~50-merDNAoligos(一对)全部制备/合成时间所需时间4天—2周24小时+DNAoligo合成时间1天+转录模版制备时间5天以上+DNAoligo合成时间~6小时+DNAoligo合成时间个人所需操作时间几乎不需要*中等中等多中等是否需要验证和寻找最有效siRNA需要需要不需要需要需要能否标记能能能不能不能第61页/共93页

比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框转染的相对难易程度好好好差差可筛选性(例如抗生素筛选)

不可以不可以不可以可以不可以能否用于长效抑制不可以不可以不可以可以（抗生素筛选）不可以能否大规模制备可以有限有限可以有限检测总体转染效率不可以不可以不可以可以不可以每个基因的相对费用（不包含人力）高中等低中等中等

比较项目化学合成体外转录RNaseIII降解dsRNAsiRNA

表达载体PCR

表达框转染的相对难易程度好好好差差可筛选性(例如抗生素筛选)

不可以不可以不可以可以不可以能否用于长效抑制不可以不可以不可以可以（抗生素筛选）不可以能否大规模制备可以有限有限可以有限检测总体转染效率不可以不可以不可以可以不可以每个基因的相对费用（不包含人力）高中等低中等中等第62页/共93页第63页/共93页第64页/共93页SiRNA的转染1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。第65页/共93页SiRNA的转染2.电穿孔法

电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。第66页/共93页SiRNA的转染3.DEAE-葡聚糖和polybrene

带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。第67页/共93页SiRNA的转染4.机械法

转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolisticparticle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。第68页/共93页SiRNA的转染5.阳离子脂质体试剂

在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。第69页/共93页使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。第70页/共93页转染实验中，需要注意问题1.纯化siRNA

在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。第71页/共93页转染实验中，需要注意问题2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。第72页/共93页转染实验中，需要注意问题3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。第73页/共93页转染实验中，需要注意问题4.避免使用抗生素

Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。第74页/共93页转染实验中，需要注意问题5.选择合适的转染试剂针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。第75页/共93页转染实验中，需要注意问题

6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。第76页/共93页转染实验中，需要注意问题7.通过标记siRNA来优化实验

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。第77页/共93页RNAi的应用前景1.研究基因功能的新工具RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，RNAi有投入少，周期短，操作简单等优势近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。第78页/共93页RNAi的应用前景2.研究信号传导通路的新途径联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系。Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关系。证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶.RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。第79页/共93页RNAi的应用前景3.开展基因治疗的新策略RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止某些基因序列过量增殖等作用。因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。第80页/