第二章基因工程制药3

目的要求1、掌握基因工程技术的概念及基因工程制药的基本过程。2、理解目的基因的获得方法，基因表达体系及不同表达体系的特点及高效表达的措施。3、掌握质粒不稳定产生的原因及提高质粒稳定性的方法。4、掌握基因工程药物的分离纯化。5、了解基因工程药物的质量控制。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前1页，总共46页。1、基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。2、宿主细胞的分类：①原核细胞，常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；②真核细胞，常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。知识回顾BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前2页，总共46页。3、提高外源基因在E.coli表达效率：（1）外源基因的剂量（2）外源基因的表达效率（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件知识回顾BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前3页，总共46页。4、真核基因在大肠杆菌中的表达形式:⑴以融合蛋白的形式表达药物基因⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因⑶分泌型表达药物基因

知识回顾BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前4页，总共46页。5、质粒的不稳定性分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前5页，总共46页。6、提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌选择合适的载体选择压力分阶段控制培养控制培养条件固定化BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前6页，总共46页。第六节基因工程药物的分离纯化基因工程药物或生物技术产品特点:(1)目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前7页，总共46页。(3)目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；

种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；

应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前8页，总共46页。一、建立分离纯化工艺的根据1、含目的产物的起始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前9页，总共46页。一、建立分离纯化工艺的根据（1）菌种类型及其代谢特性：（2）原材料和培养基的来源及其质量；（3）生产工艺和条件：（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前10页，总共46页。一、建立分离纯化工艺的根据2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前11页，总共46页。一、建立分离纯化工艺的根据3、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前12页，总共46页。一、建立分离纯化工艺的根据4、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前13页，总共46页。二、分离纯化的基本过程由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前14页，总共46页。基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前15页，总共46页。三、分离纯化的技术1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；3）收率要高；4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前16页，总共46页。3-1、细胞破碎与固液分离

（1）细胞收集：离心和膜过滤（2）细胞破碎：机械法高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。（3）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前17页，总共46页。3-2、目的产物的分离纯化

分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。色谱技术分为：

IonexchangechromatographyHydrophobicinteractionchromatographyAffinitychromatographyGelFiltrationchromatographyBiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前18页，总共46页。

表1产物的主要特性及在分离纯化中的作用产物特性作用

等电点决定离子交换的种类及条件

相对分子质量选择不同孔径及分级分离范围的介质

疏水性与疏水、反相介质结合的程度

特殊反应性产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制

聚合性是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用的温度及流程时间微不均一性影响产物的回收BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前19页，总共46页。

表2基因工程药物生产中常用的分离纯化方法

方法目的

离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质阴离子交换层析去除杂志蛋白、脂质、DNA、病毒40nm微孔滤膜过滤进一步去除病毒阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0.22μm微孔滤膜过滤除菌BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前20页，总共46页。1）具有良好的稳定性和重复性；2）尽可能减少组成工艺的步骤；3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺和设备相适应。4）在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量；

3-3、分离纯化工艺应遵循的原则BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前21页，总共46页。5）分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性差的产物；6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低；7）具有较高的安全性。3-3、分离纯化工艺应遵循的原则BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前22页，总共46页。第七节基因工程药物的质量控制一、原材料的质量控制

确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前23页，总共46页。一、原材料的质量控制（1）明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等予以确证；（2）提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分（如启动子、复制子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物；BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前24页，总共46页。（3）提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；（4）阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；一、原材料的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前25页，总共46页。（5）提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。一、原材料的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前26页，总共46页。在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前27页，总共46页。（1）生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库；（2）原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性；二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前28页，总共46页。（3）对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前29页，总共46页。（5）培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；以宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品；二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前30页，总共46页。（6）培养周期结束时，应检测宿主宿主细胞载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前31页，总共46页。三、纯化工艺中的质量控制1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核算、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前32页，总共46页。四、目标产品的质量控制

电泳方法：SDS,等电聚焦，免疫电泳免疫学方法：RIA,RIDELISA,Immunoblotting受体结合实验（ReceptorBinding）各种高效液相分析法（HPLC）肽图分析法EdmanN末端序列分析法圆二色谱（CD）NMR1、产品的鉴别表3重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前33页，总共46页。（1）肽图分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15个氨基酸（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定（5）蛋白质二硫键分析1、产品的鉴别BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前34页，总共46页。2、纯度分析（1）目的蛋白质含量测定（2）杂质：分蛋白类杂质和非蛋白类杂质。3、生物化学测定4、稳定性考察5、产品一致性的保证1、产品的鉴别BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前35页，总共46页。

杂质和污染物检测方法

内毒素鲎试剂、家兔热源法宿主细胞蛋白免疫分析、SD、CE其他蛋白杂质（如培养基）SDS、HPLC、CE、免疫分析残余DNADNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异肽谱、HPLC、IEF、CE甲酰基甲硫氨酸肽谱、HPLC、IEF、CE表4基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前36页，总共46页。

甲硫氨酸氧化肽谱、氨基酸分析、HPLC、质谱、Edman分析产物变性或聚合脱氨基SDS、凝胶排阻色谱、IEF、HPLC、Edman分析、CE亲和配基脱落SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽谱、CE、Edman分析、质谱微生物（细菌、酵母、真菌）微生物学检查支原体微生物学检查病毒微生物学检查表4基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药当前37页，总共46页。五、产品的保存1、液态保存（1）低温保存（2）在稳定pH条件下保存（3）高浓度保存（4）加保护剂保存BiotechnologicalPharmaceutics基因工程