基因表达沉默技术

基因表达沉默技术第一页，共六十二页，2022年，8月28日1教学内容及要求1234反义核酸技术核酶技术基因敲除技术RNA干扰技术重点熟悉第二页，共六十二页，2022年，8月28日2参考资料《基因工程及其分子生物学基础-基因工程分册》，北京大学出版社，静国忠编自备材料（个人实践经验）第三页，共六十二页，2022年，8月28日3第一节RNA干扰技术第四页，共六十二页，2022年，8月28日4基本概念掌握RNA干扰(RNAinterference,RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。小干扰RNA:具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA（SmallinterferingRNA,siRNA)。第五页，共六十二页，2022年，8月28日5注射sense秀丽线虫antisense注射1995年．．．．．．发现历史第六页，共六十二页，2022年，8月28日6反义RNA(antisenseRNA)对基因抑制效应比较微弱；而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的表达。

animportantfinding！．．．．．．1998年第七页，共六十二页，2022年，8月28日7

CraigC.Mello

克雷格·梅洛AndrewZ.Fire安德鲁·菲尔2006NobelPrizeinPhysiologyorMedicine第八页，共六十二页，2022年，8月28日8随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi现象的普遍性第九页，共六十二页，2022年，8月28日9靶RNAi机制siRNA在ATP参与下形成RISC复合体，被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中的反义链指导移至靶mRNA，靶mRNA被切割后诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。外源长dsRNA在ATP作用下被RNaseⅢDicer切割成21nt左右、由正义和反义链组成的siRNA重点第十页，共六十二页，2022年，8月28日10siRNA19bpduplex2nt3’overhangs21ntsiRNA实验设计难点第十一页，共六十二页，2022年，8月28日111）靶序列的调出NationalCenterfor

BiotechnologyInformation

第十二页，共六十二页，2022年，8月28日12第十三页，共六十二页，2022年，8月28日13第十四页，共六十二页，2022年，8月28日142）利用免费设计软件进行siRNA设计InvitrogenTakaraOligoegine

第十五页，共六十二页，2022年，8月28日15软件的选择原则1、选择可读框内、翻译起始位点之后50～100nt的序列作为靶序列；2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；4、碱基数目控制在19～21nt；5、避免连续3个或3个以上的相同碱基；6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。第十六页，共六十二页，2022年，8月28日16我用的软件：siDirect第十七页，共六十二页，2022年，8月28日173）siRNA合成或表达RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）：转录起始点明确；转录生成小RNA；转录产物无polyA尾；转录终止为5个连续的U。第十八页，共六十二页，2022年，8月28日18第十九页，共六十二页，2022年，8月28日19第二十页，共六十二页，2022年，8月28日20第二十一页，共六十二页，2022年，8月28日213mg/ml正向引物1μl3mg/ml反向引物1μl90°C4min70°C10min室温订购合成的引物序列退火第二十二页，共六十二页，2022年，8月28日224)siRNAworking?第二十三页，共六十二页，2022年，8月28日23mRNA:Real-timePCRProtein:Westernblot17siRNAMock第二十四页，共六十二页，2022年，8月28日245)合成or构建载体？化学合成siRNA：

瞬时转染实验花费高使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达siRNA。C.载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体。第二十五页，共六十二页，2022年，8月28日256）体外导入细胞a.脂质体转染：＋＋＋＋＋－－－－－－＋具体操作步骤：按照脂质体说明书进行第二十六页，共六十二页，2022年，8月28日26b.电穿孔导入：第二十七页，共六十二页，2022年，8月28日27c.病毒感染（以腺病毒为例）：第二十八页，共六十二页，2022年，8月28日28next第二十九页，共六十二页，2022年，8月28日29第二节反义核酸技术第三十页，共六十二页，2022年，8月28日301978年，Stephenson和Zamecnik首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的复制现象。1984年，Izantweintraub提出了“反义核酸技术”的概念。InhibitionofRoussarcomaviralRNAtranslationbyaspecificoligodeoxyribonucleotide.ProcNatlAcadSciUSA,1978;75:285-288.历史由来第三十一页，共六十二页，2022年，8月28日31反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义DNA和反义RNA。基本概念反义RNA技术反义DNA技术第三十二页，共六十二页，2022年，8月28日32反义抑制的主要机理直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶H降解。反义核酸mRNARNaseH第三十三页，共六十二页，2022年，8月28日33论著超过１６０００篇。基因功能研究（1994年流行）

如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。反义核酸应用第三十四页，共六十二页，2022年，8月28日341998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物“Vitravene”（福米韦生，fomivirsen）在美国上市。该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。2１个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成５＇－ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ－３＇

第三十五页，共六十二页，2022年，8月28日35a.避免内源性核酸酶对其降解b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力Hdeoxyribose提高有效性技术难点修饰第三十六页，共六十二页，2022年，8月28日36第一代硫代修饰（Phosphorothioate）ResistingToNucleases；ActivatingRNaseHpathwaysO第三十七页，共六十二页，2022年，8月28日37第二代修饰(2’-O-methyl,2’-O-methoxyethyl)ResistingToNucleases；notactivatingRNaseHpathways第三十八页，共六十二页，2022年，8月28日382001主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症

Macugen哌加他尼第三十九页，共六十二页，2022年，8月28日39

2003新一代抗HIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物

Fuzeon

20570$第四十页，共六十二页，2022年，8月28日40Tysabri2004专治多发性硬化症

第四十一页，共六十二页，2022年，8月28日41next第四十二页，共六十二页，2022年，8月28日42第三节核酶技术第四十三页，共六十二页，2022年，8月28日43核酶（ribozyme）ribonucleicacidenzyme具有催化活性的RNA，化学本质是RNA,却具有酶的催化功能。基本概念第四十四页，共六十二页，2022年，8月28日44切赫(T.R.Cech)（1947-），美国人,他独立地发现发现四膜虫转录产物rRNA前体，可切除自身的413个核苷酸的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。历史由来ThomasR.Cech1982

第四十五页，共六十二页，2022年，8月28日45S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，留下RNA能够切割rRNA前体的5’端。1983

第四十六页，共六十二页，2022年，8月28日461989NobelPrizeinChemistry核酶的发现改变了“所有酶都是蛋白质”的传统观念第四十七页，共六十二页，2022年，8月28日47

有封闭切割RNA应用——阻断基因的表达（1994年左右比较流行的研究工具）第四十八页，共六十二页，2022年，8月28日48通常由60个核苷酸左右组成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13个碱基。锤头状核酶结构示意图第四十九页，共六十二页，2022年，8月28日49next第五十页，共六十二页，2022年，8月28日50第四节基因敲除技术时间：80年代末功能：建立基因失活或缺失的动物模型第五十一页，共六十二页，2022年，8月28日51发展历史a.胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）分离培养取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞能在体外培养，保留发育的全能性

1981年，马丁·埃文斯(MartinJ．Evans)从正常的小鼠囊胚中分离到了ES细胞。小鼠ES细胞的分离和应用是ES细胞技术发展的里程碑。第五十二页，共六十二页，2022年，8月28日52同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似DNA序列间的重组，通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。b.同源重组技术应用第五十三页，共六十二页，2022年，8月28日531985年，奥利弗·史密塞斯(OliverSmithies)等首次报道在肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源β-球蛋白基因间的同源重组。第五十四页，共六十二页，2022年，8月28日541988年，卡佩基安德等发展了一种称为“正负筛选”的策略，将胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打靶载体的外侧，作为筛选的负性标记。这比单用阳性筛选正确克隆富集的倍数高3~10倍，真正使得同源重组技术得以应用。马里奥·卡佩基安德(MarioR．Capechiand)丙氧鸟苷第五十五页，共六十二页，2022年，8月28日55MartinEvans马丁·埃文斯MarioCapecchi马里奥·卡佩基OliverSmithies奥利弗·史密斯第五十六页，共六十二页，2022年，8月28日56原理和操