仪器及药物分析荧光质谱

仪器及药物分析荧光质谱第一页，共七十二页，2022年，8月28日五、荧光分子光度法（一）基本原理（二）荧光分光光度计（三）特点、方法与应用第二页，共七十二页，2022年，8月28日荧光（fluorescence）现象的第一次记录：1575年，西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，观察到LignumNephriticum木头切片的水溶液呈现天蓝色。第一次被提议用于分析：1864年，Stokes第一次用于分析：1867年，Goppelsröder根据Al-桑色素配合物的荧光，建立了Al3+的荧光测定方法。第三页，共七十二页，2022年，8月28日当物质分子吸收了一定波长的紫外光能之后，基态电子跃迁到第一激发态，处于激发态的电子首先以无辐射的方式下降到第一激发态的低能级，而后再回到基态时，所发射出的光称为荧光。荧光是一种以光能为激发源的发射光，且波长比激发态波长更长，所以，利用物质的荧光现象而建立的分析方法称为荧光分光光度法。（一）基本原理第四页，共七十二页，2022年，8月28日第五页，共七十二页，2022年，8月28日荧光定量分析原理荧光是由物质在吸收光能之后产生的发射光，其荧光强度与物质吸收光能的程度和产生荧光的物质有关。荧光效率φ——反映荧光强度的重要参数荧光强度If

应与荧光物质的吸光强度(I0

－I

)和荧光效率φ成正比，即If=φ(I0

－I

)根据朗伯–比尔定律，和有关的运算，在一定的条件下，得：If=2.3φ

I0εcl=Kc

第六页，共七十二页，2022年，8月28日（二）荧光分析光度计光源激发单色器样品池发射单色器检测器信号处理显示I0

IfI第七页，共七十二页，2022年，8月28日荧光分光光度计部件1．光源：钨灯、汞灯、氙灯、激光激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。2．单色器：滤光片、光栅激发单色器和发射单色器3．检测器 PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice4．信号处理第八页，共七十二页，2022年，8月28日JobinYvonFluorolog-3荧光光谱仪1.稳态：S/Nmin4000:1(光子计数和全反射光路)

2.10us-10s以上(磷光寿命)10ps-10us(荧光寿命)

3.波长范围：200-900nm(UV-VIS-NIR)

4.扫描速度：150nm/s第九页，共七十二页，2022年，8月28日灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1μg/cm-3

相对灵敏度：（0.05MH2SO4)选择性高重现性好取样量少仪器不复杂（三）荧光分析方法的特点、方法及应用1．特点

第十页，共七十二页，2022年，8月28日2．方法及应用

检测：金属离子、有机物、生物分子生物分子相互作用研究疾病诊断定性分析：依据不同结构的物质所发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。分析方法直接荧光法（能产生较强荧光的药物）间接荧光法（不能产生荧光或荧光很弱的药物）第十一页，共七十二页，2022年，8月28日第十二页，共七十二页，2022年，8月28日第十三页，共七十二页，2022年，8月28日六、有机质谱法1.质谱基本知识质谱仪质谱分析原理质谱图2.离子峰的主要类型3.有机质谱中的裂解反应4.有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图第十四页，共七十二页，2022年，8月28日质谱法将化合物分子在高真空条件下，用高能电子轰击或强电场使其电离，电离产物按质荷比(m/z)大小进行分离记录所得图谱即所谓的质谱图。基峰第十五页，共七十二页，2022年，8月28日高真空条件

10-4-10-6Pa质荷比质量/电荷分离聚焦电离电场或高能电子轰击(~70ev,~6,000KJ.mol-1)M＋e-→M

＋2e-

•第十六页，共七十二页，2022年，8月28日（1）质谱计

质谱计须有进样系统、电离系统、质量分析器和检测记录系统。为了获得良好分析，必须避免离子和气体分子的碰撞，凡有样品分子及离子存在和通过的地方，都处于真空状态。进样系统电离系统质量分析器检测记录系统1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离和场解吸4.快原子轰击5.电喷雾电离1.单聚焦2.双聚焦

高真空系统第十七页，共七十二页，2022年，8月28日电子轰击利用高速电子束撞击气态分子，将分解出的阳离子高速导入质量分离器中，按质荷比（m/z）的大小顺序收集，并以质谱图记录下来，根据质谱峰位置进行定性和结构分析，或根据强度进行定量分析。化学电离高能电子束和小分子反应气体，甲烷等，反应生成初级离子，CH4+.，再和样品分子反应，使之电离。强致电离

电场作用下，汽化样品分子的电离第十八页，共七十二页，2022年，8月28日场解吸不需要汽化，将样品吸附在处理过的金属尖端，通以微电流，金属成为场离子发射体，使样品解吸，离子化。快原子轰击高能原子束轰击，采用基质负载样品，用于不稳定的极性分子。电喷雾电离样品溶液在强静电场作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，溶剂不断挥发，液滴裂分，最终形成带电离子，可用于分子量大于20000的生物分子和络合物分析。第十九页，共七十二页，2022年，8月28日离子源重离子路径离子收集器第二十页，共七十二页，2022年，8月28日离子源结构第二十一页，共七十二页，2022年，8月28日（2）质谱分析原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与势能相等，即(1/2)m

2=zU

质量为m,电荷为z的正电荷离子，经外加电场U的加速，离子的运动速度为υ。在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行；

向心力=离心力；Hz=m

2/R第二十二页，共七十二页，2022年，8月28日质谱方程式：m/z=(H2R2)/2U离子在磁场中的轨道半径R取决于：m/z、H

、U向心力=离心力；Hz=m

2/R固定U值，将H由小到大连续改变,在狭缝收集的离子的m/z比也由小到大地改变。第二十三页，共七十二页，2022年，8月28日单聚焦质谱计双聚焦质谱计第二十四页，共七十二页，2022年，8月28日各种峰表示不同质/荷比的离子；纵坐标以相对丰度表示，峰越高表示形成的离子越多；（即谱图中以最强峰高为100%，分别计算其他峰强度）（3）质谱图基峰：质谱图中离子强度最大的峰第二十五页，共七十二页，2022年，8月28日六、有机质谱法1.质谱基本知识2.离子峰的主要类型分子离子峰同位素离子峰碎片离子峰重排离子峰两价离子峰3.有机质谱中裂解反应4.有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图第二十六页，共七十二页，2022年，8月28日（1）分子离子峰质谱信号十分丰富。分子在离子源中可以产生各种电离，即同一种分子可以产生多种离子峰，其中比较主要的有分子离子峰、重排离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰等。试样分子在高能电子撞击下失去一个价电子，即

M＋e-→M

＋2e-

生成的离子称为分子离子或母离子。其中“+”代表正离子，“.”代表不成对电子。•分子离子的质量与化合物的分子量相等。第二十七页，共七十二页，2022年，8月28日分子离子母离子奇电子离子碎片离子+.第二十八页，共七十二页，2022年，8月28日质谱图上哪个是分子离子峰，哪个是基峰？思考！13057298710141第二十九页，共七十二页，2022年，8月28日有机化合物分子离子峰的相对强度：在质谱中，分子离子峰的强度和化合物的结构有关。环状化合物比较稳定，不易碎裂，因而分子离子较强。支链较易碎裂，分子离子峰就弱，有些稳定性差的化合物经常看不到分子离子峰。芳香化合物＞共轭链烯＞烯烃＞脂环化合物＞直链烷烃＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支链烷烃＞醇．第三十页，共七十二页，2022年，8月28日M=93Ｎ律——分子中若含有偶数个氮原子，则相对分子质量将是偶数；反之，将是奇数。这就是所谓的“氮律”。第三十一页，共七十二页，2022年，8月28日例如：CH4M=1612C+1H×4=16M13C+1H×4=17M+112C+2H+1H×3=17M+113C+2H+1H×3=18M+2同位素峰分子离子峰（2）同位素离子峰（M+1峰）

由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个质量单位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3…….；1615m/zRA13.1121.0133.9149.2158516100171.1m/z第三十二页，共七十二页，2022年，8月28日（3）碎片离子峰

一般有机化合物的电离能为7－13电子伏特，质谱中常用的电离电压为70电子伏特，过剩的能量使分子离子化学键断裂，产生各种“碎片”离子。第三十三页，共七十二页，2022年，8月28日H3CH3CC=O+·–CH3·CH3–C≡O+–COCH3+M+·=58m/z=43m/z=15碎片可以来剖析分子的结构第三十四页，共七十二页，2022年，8月28日常见丢失碎片常见稳定离子第三十五页，共七十二页，2022年，8月28日（4）重排离子峰当分子中裂解为碎片离子时，在键断链的同时，分子内部的原子或基团重排，形成随片离子，这种离子产生的质谱峰称为重排离子峰。第三十六页，共七十二页，2022年，8月28日（5）两价离子峰分子受轰击后，失去两个电子，形成M2+离子，M2+离子产生的质谱峰称为两价离子峰。一些杂环、芳环和高度不饱和的化合物也易形成两价离子峰，而决大多数药物和毒物均有杂环和芳环结构。

除上述离子峰外，还可能有亚稳离子峰以及碎片与中性碎片反应形成的离子峰等。对于一张未知化合物的质谱图进行解析时，必须慎重、全面考虑。第三十七页，共七十二页，2022年，8月28日六、有机质谱法1.质谱基本知识2.离子峰的主要类型3.有机质谱中裂解反应自由基引发的裂解反应自由基引发的重排反应4有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图生物质谱第三十八页，共七十二页，2022年，8月28日α―裂解C-Y或C=Y（Y=O，N，S）基团的化合物与这些基团相连的化学键断裂。自由基或电荷定位在分子中某个特定的位置上，然后以一个电子或电子对的转移来引发裂解反应。C的价电子基本上都用于成键；O，N，S有非键电子（1）自由基的位置引发的裂解反应第三十九页，共七十二页，2022年，8月28日α―裂解CH3(CH2)9CH2NH2M=15730α―裂解——丢失最大烃基的可能性最大丢失最大烃基原则第四十页，共七十二页，2022年，8月28日麦氏重排（Mclaffertyrearrangement)位的H

转移到杂原子上，同时键发生断裂，生成一个中性分子和一个自由基阳离子（2）自由基位置引发的重排反应键断裂的同时有氢原子发生转移，产生重排离子；第四十一页，共七十二页，2022年，8月28日六、有机质谱法1.质谱基本知识2.离子峰的主要类型3.有机质谱中裂解反应4有机化合物的一般裂解规律和常见质谱图烃类化合物的裂解杂原子化合物的裂解常见质谱图第四十二页，共七十二页，2022年，8月28日（1）烃类化合物的裂解优先失去大的基团，优先生成稳定的正碳离子。C6H5CH2+

CH2=CHCH2+

R3C+

R2CH+

RCH2+

CH3+稳定性第四十三页，共七十二页，2022年，8月28日①直链烷烃正癸烷ΔM=14M-29CH3CH2CH2+CH3CH+CH3异构化生成稳定的正碳离子第四十四页，共七十二页，2022年，8月28日有m/z：29，43，57，71，……CnH2n+1系列峰ΔM=14M-29基峰为43或57第四十五页，共七十二页，2022年，8月28日②支链烷烃CH3CH2CH2CH2CH3C+（CH3）2第四十六页，共七十二页，2022年，8月28日③环烷烃环烷烃分子离子峰较强第四十七页，共七十二页，2022年，8月28日第四十八页，共七十二页，2022年，8月28日④烯烃41基峰是烯丙基正离子，M=41CH2=CHCH2+第四十九页，共七十二页，2022年，8月28日⑤芳香烃第五十页，共七十二页，2022年，8月28日第五十一页，共七十二页，2022年，8月28日第五十二页，共七十二页，2022年，8月28日ΔM=14M-29基峰为43或57直链烷烃和支链烷烃质谱图有什么异同之处？支链烷烃有M-15环烷烃分子离子峰较强芳香烃苄基正离子一般是基峰（91）有苯环断裂的特征峰77，65，37…..烯烃的基峰一般是烯丙基正离子，M=41小结第五十三页，共七十二页，2022年，8月28日特征：m/z=31+n*14;CH2=OH；出现M-18峰,失去一分子的水；+（2）含杂原子化合物的裂解醇，酚，醚类的裂解第五十四页，共七十二页，2022年，8月28日第五十五页，共七十二页，2022年，8月28日M-18第五十六页，共七十二页，2022年，8月28日第五十七页，共七十二页，2022年，8月28日第五十八页，共七十二页，2022年，8月28日苄醇：M-1峰比较强；m/z=79峰比较特征.苯酚的质谱与苄醇会有什么不同呢？基峰第五十九页，共七十二页，2022年，8月28日苯酚94的峰强，77的峰很弱。第六十页，共七十二页，2022年，8月28日（3）常