家猪干扰素ω及δ基因家族的特征及抗蓝耳病应用分析

————————————-———_——_-_————-_—-—_——_-___—_-_-—_——————————————_——————_————————————一一————————————-———_——_-_————-_—-—_——_-___—_-_-—_——————————————_——————_————————————一一博士学位论奎 窒堡王些鲞!=：丝!墨望塞鉴堕壁堡垒垫堕曼堕皇旦塑壅主要英文缩写列表英文缩写 英文全称 中文名称antibody-dependent 抗体依赖性病毒作用增强的现ADEen—hancement 勇0APC Antigen-presentingcell 抗原递呈细胞CPE Cytopathiceffect 细胞病理学效应CBM Cytokinebindingmodules 细胞因子结合区域CNTF Ciliaryneurotrophicfactor 睫状神经营养因子DC Dendriticeell 树突状细胞GAS y-activationsequence 干扰素丫激活序列ID50 50％infectivedose 半数感染剂量IFN Interferon 干扰素IL Interleukin 自介素Interferon stimulate responseISItE 干扰素激活反响序列elementInterferon-activatedtranscriptionISGF3 干扰素激活转录因子复合体3factor3Ⅱ啦Interferonregulatoryfactor干扰素调节因子IGFsInterferonregulatoryfators干扰素调节因子ISGsInterferonstimulategenes于扰素刺激基因JAKJanusKinaseJanus激酶LIF Leukemiainhibitoryfactor 白血病坏死因子ML MaximumLikelihood 最大拟然法Major histocompatibilityMHC 组织相容性复合物complexNLS nuclear-localizationsi弘al 细胞核定位信号OAS oligoadenylatesynthetase 寡腺苷酸合成酶博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及8基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究ORF Openreadingframe 开放读码框P“pheralbloodPBMCs m。n。nuclear外周血单核细胞cellsPm Phage-formingunit 噬菌斑形成单位PKR ProteinkinaseR 蛋白激酶R．、，、，、Porcine reproductivePRRS and家猪繁殖与呼吸综合症respiratorysyndrome．、．、．、，Porcine reproductivePRRSV and家猪繁殖与呼吸综合症病毒respiratorysyndromevirusPRV PseudorabiesVirus 伪狂犬病毒SingleSNP Nucle。‘ide单核苷酸多态性Polymorphismssi印altransducersandSTf蛆 ac。iV砒。rS信号转录激活因子oftranscriptionTCID50 50％tissuecultureinfectivedose 半数细胞感染剂量TLR Toll—likereceptor Toll样受体TNF TumorNecrosisFactor 肿瘤坏死因子Thcell Thelpercell 辅助T细胞VRE Virus—responsiveelemrnts 病毒反响元件VSV VesicularStomatitisVirus 水疱性口炎病毒2博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究第一局部综坏Ⅺ∑3博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究第一章I型干扰素的进化与信号通路摘要：I型干扰素是一种广泛应用于抗病毒，抗肿瘤和免疫调控方面的细胞因子。首先，我们从干扰素的进化入手，讨论了I型干扰素在鱼类、鸟类和哺乳动物中的不同形式。并具体的分析了哺乳动物中I型干扰素各亚型的进化及功能。随后，我们具体分析了从病毒诱导干扰素表到达干扰素发挥抗病毒作用流程中的各个步骤：病毒诱导干扰素的产生，干扰素与受体结合激活下游信号，干扰素激活的信号通路活化干扰素相关基因的表达，干扰素相关基因发挥抗病毒作用等。我们总结了参于此信号通路的具体蛋白分子，并由此进一步分析了病毒通过对这些步骤中的具体环节的作用，从而到达免疫逃逸目的的过程。关键词：I型干扰素，进化，型／亚型，病毒，信号通路，JAK／STAT,ISG中图分类号：Q78博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰索u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究TheevolutionandsignahngpathwayofTypeIinterferonsAbstract：TypeIinterferoniSthecytokinewidelyusedinantiviral，antitumoralandimmunomodulataryfields．Inthispart，wediscussedtheevolutionofTypeIinterferons．Weanalysedtheirexistenceinfish，birdandmammals，speciallytheevolutionandfunctionsoftheTypeIinterferonsinmammals．Furthermore，weanalyzedtherelationshipbetweenTypeIinterferonandvirusindetailsofsignalingpathway．WediscussedthestrategyandinvolvedmoleculesoftheinductionofIFNbyviruses，thebindingofIFNandreceptorsandinductionofdownstreamsignals，theactivationoflSGsbytheIFNinducedsignalmolecules，andtheantiviralprocedureofISGs．Finally,wespecificlydiscussedhowvirusescircumventtheinterferonactivity．Keywords：TypeIinterferon，evolution，type／subtype，virus，signalingpathway,JAK／STAT,ISG博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究干扰素(interferons，IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤、刺激免疫应答等功能的蛋白质家族。在人和动物体抵御病毒入侵、杀伤肿瘤细胞、刺激体液免疫及细胞免疫、调节生理平衡方面起到重要的作用。干扰素大致分为I型干扰素和II型干扰素两个大类。目前已经报道的I型干扰素由七个亚型组成：IFN．扒IFN．D、IFN．∞、IFN．K、IFN-￡、IFN．6、IFN．t和IFN．‘(1imitin)，II型干扰素只存在IFN．y一种[1．6]。IFN．九是近年来被发现的干扰素，包括IFN．kl、IFN．k2和IFN．k3(又称为IL．28A，IL．28B，IL．29)。IFN．九与I型干扰素具有类似的生物学活性，但在作用方式上有较大差异[7，8]。本综述简要概述了I型干扰素的进化，分类及作用信号通路。一、I型干扰素基因家族进化及分类I型干扰素在进化中最早出现于鱼类中。随着脊椎动物由低等到高等的进化，I型干扰素基因家族也不断的壮大，逐渐分支出各型以及各亚型。这里分为鱼类、鸟类和哺乳动物三个局部分别讨论了I型干扰素进化树上个分支的起源，去向及在不同种动物中的分布等(图1．1．)[9】。1．鱼类I型干扰素：鱼类I型干扰素基因与高等脊椎动物有两点区别：首先，迄今为止在鱼类I型干扰素中还没有发现任何基因重复现象，说明鱼类中I型干扰素位点上只有一份拷贝。虽然在鲑鱼中发现了两种不同的I型干扰素基因，但它们很可能是等位基因。在两种非常接近的斑马鱼∞．rerio)@的I型干扰素的区别那么是源于不同的实验室或农业培养，属于种属特异性范畴【lo'111。其次，大多数I型干扰素基因是由5个外显子和4个内含子组成的【¨】，内含子的位置与IL．28，IL．10。IL．20，IL-24，和IL．26基因相似。有趣的是，青鳝(O．1atipes)的I型干扰素基因与IFN吖而不是那些有5个外显子的II型细胞因子类似，因为它本来应该是第3和第4个外显子的两局部是合在一起的】。这种现象极有可能是在从四足虫的进化过程中，单拷贝的干扰素基因由于反转录之类的原因丧失了内含子所致。由于在两栖类中找不到I型干扰素基因，上述过程在进化中发生在哪个阶段目前尚不明了。此外，鱼I型干扰素基因另一个独特的地方是：其分化的方式与鱼的种群分化并不吻合【9J。曾有报道说明，鱼中至少有两种不同种的干扰素【12】。并且在干扰素受体分析中我们也发现CRFBl和CRFB2两个编码干扰素受体的基因。推测可能在鱼类中存在一种与同源性很低的新型干扰素基因。对任意种群鱼中任一I型干扰素基因的随机检测均一致，没有种群内部的分化。支持这个结论的还有，虹鳟(O．mykiss)某一EST编码一个可能的5外显子序列与其中发现的其它I型博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究干扰素基因fNCBI序列号：Bx858275／AJ582754)不同，但与I型干扰素基因有一定的同源性。此外，在斑马鱼∞．rerio)基因组中，已探明有一个全长的I型干扰素基IN(BX323464)N已报道的斑马鱼I型干扰素基因区别较大，但仍属于鱼I型干扰素分支[13】。这些远源的单克隆IFN基因可能起源于在包括斑马鱼的一些硬骨鱼中，距今年代更近的基因重复【141。图I．I．鱼类，鸟类和局部哺乳动物I型干扰素进化分析19I。博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰索u及8基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究2．鸟类I型干扰素：从鸟类与哺乳动物I型干扰素形成各自的进化分支来看，它们起源于某单个编码序列。鸟类I型干扰素已报道的有两个不同类型：IFNI和IFNIIil5—61。从图1．1．中的进化树中可以看出，IFNI和IFNII均处于鸟类I型干扰素的单独分支中，而不是哺乳动物IFN．Q和IFN．B在鸟类中的形式。在鸟类干扰素中，多数与鸡IFNI有较高的同源性，只有一种鸭IFN和一种鹅IFN与鸡IFNII同源性较高【171。IFNI有基因重复现象，而IFNII没有【181。近年来，对鸡基因组的研究发现一种新的I型干扰素(EnsemblcontigfileContig126．32511．6853)，命名为IFNIII。鸡的基因组中还存在一条属于IFNIII的假基因。令人惊讶的是，与IFNI和IFNII不同的是，IFNIII隶属于哺乳动物I型干扰素的分支。序列比照也可看出它更相似于哺乳动物I型干扰素而不是鸡的[FNI。对于此型干扰素的进化研究，及其在除鸡外的其他鸟类中或是爬行动物同源基因的分析，将是未来很有意义有很具挑战性的一项工作【91。3．哺乳动物I型干扰素：哺乳动物I型干扰素基因家族中存在着很多的型，其中某些型之中还分出了亚型，再加上夹杂在各功能基因中的假基因，形成了一个庞大的系统【16】。在哺乳动物中较低级的种类，如胎儿体外发育的单孔目哺乳动物针鼹鼠中，I型干扰素基因数量与鸡基因组中相似。在已进化到有胎盘的有袋动物和真哺乳亚纲的动物中，干扰素基因的重复现象增加。对鼠，人，牛等动物基因组中各I型干扰素的研究进一步证明了这个观点【19-25]。在哺乳动物基因组中发现的主要I型干扰素亚类群有：IFN吨，IFN．13，IFN．∞，IFN．t，IFN．1(等【1，2，4，5，16，26，271。从系统发生上来讲，哺乳动物I型干扰素亚类群可被定义为I型干扰素中，各干扰素与不同种类哺乳动物协同进化的产物。下面具体分析哺乳动物I型干扰素的各个亚类群分支：IFN—K：哺乳动物I型干扰素中第一个分支类群，是迄今为止发现的唯一带内含子的哺乳动物I型干扰素基因。IFN．K在进化中的定位与其在基因组中的位置是一致的，它在很多哺乳动物基因组中位置均与其他I型干扰素相距较远。我们预测IFN—K应该存在于所有种类的哺乳动物中，尽管到现在为止，只在小鼠、人、和大鼠基因组中发现，并在负鼠，黑猩猩，恒河猴，狗和牛的基因组中发现可能为IFN-K的序列(AAFR01024869．1，XM528579，zfq61b03．gl。AF547990，NM_020234，XM_232873，CEl56804，andCC549887)。IFN-K主要由角化细胞，也由树突和巨噬细胞分泌的，抗病毒作用相对于其他干扰素较弱14,28,291。IFN．K被认为主要在表皮免疫中起作用。哺乳动物由于已进化出可以维持体温的系统，博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究其体表覆盖物也由毛发代替了硬壳。这就使得表皮容易受到外界刺激伤害，更容易通过空气传播或者接触感染。由皮肤特别分泌的干扰素在此时抵御感染方面起着重要的作用【9】oIFN．￡：IFN．B，IFN-￡，IFN-v和鸟类IFN．III共同组成了哺乳动物I型干扰素基因进化树中一个大的分支。IFN一￡是一种在多种动物种系中发现的干扰素，对它的结构分析发现，它在起源上可能与IFN．B相近，如l位Cys对的缺失。一些研究认为IFN-￡是在IFN．D进化到有袋动物和真哺乳亚纲的动物之间时起源的。因为IFN．￡在塔马尔沙袋鼠，短嘴针鼹基因组中并没有发现【30】。IFN-￡在已测序的人、小鼠、大鼠和牛的基因组中均有发现，(AY358570NM177348，AYl90044XM233165，AAFC01008084．1)。对IFN．￡的作用尚不清楚，但推测其在胎儿免疫及胎儿与母体间免疫系统的相互识别方面有作用[9】。IFN-p从进化树中可以看出，IFN．p是在紧接IFN．￡之前分化出的一支分支。IFN．p是最古老而保守的一支I型干扰素基因。它在包括有袋动物在内的几乎所有哺乳动物种系中均有存在，证明其在哺乳动物进化中起源较早【30’3¨。根据其保守的Cys位点缺失判断，单孔类动物中IFN．pl应属于IFN．p分支，但在运用生物信息学的进化树构建中，却发现它被分在了IFN-v一支【30】。除了牛之外，其余真哺乳动物亚纲动物基因组中均只存在一条IFN。D基因，而在有袋类动物和卵生／卵胎生动物中却存在多条。至于在多数哺乳动物中，缺乏IFN．D基因重复的原因，至今仍是个有待研究的课题。在小鼠中敲除IFN．B基因，会导致小鼠无法激发机体的抗病毒保护作用【321。在所有的基因组序列中，IFN．D总是位于I型干扰素基因序列群的最后。IFN．D主要由纤维原细胞分泌，上皮细胞，内皮细胞，淋巴细胞，星形胶质细胞等也有少量分泌【21。IFN．B主要起抗病毒作用。通过病毒感染诱导细胞IFN．B的表达被认为可以介导小鼠大量表达IFN．伍，此机制在人中也可能存在[331。相对于IFN．Ⅸ来说，IFN．p起免疫抑制作用的同时伴随着较少的胞毒作用，因而在多发性硬化症的治疗方面有较大的优势【34，35】IFN-v与IFN—p和IFN_￡相似，IFN-v在动物基因组中位置是保守的，它的翻译总是与IFN．p协同。在猫基因组中存在着完整的IFN-v基因位点(ACl343231)，而在其他种类如狗，猪，鼠，人，树懒，和黑猩猩基因组中也有发现同源的序列，但均已在近期(灵长目，狗)或很久之前(鼠，猪)失去作用变成了假基因。基因组中这些基因或假基因的存在在哺乳动物免疫系统作用中，曾经需要IFN-v但后博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素63及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究来出现了变化。目前尚不明确IFN-v的作用是什么，以及为什么单独在猫基因组中存在它的活性基因。还有一个有趣的现象是，尽管IFN-v基因早在灵长类动物两千到三千万年前的祖先基因组中就已失活为假基因，但其序列保守性却相当强。其中人，树懒，和黑猩猩IFN-v基因终止密码子的失活突变(UAA)完全相同[36-39]。据此推测，IFN-v假基因可能也有其作用。Limitin／IFN．6：鼠的Limitin干扰素与猪的IFN．6处于进化的同一个大分支上。Limitin与多数动物的IFN．6基因在基因组中均位于IFN．p和IFN-￡之间，向IFN．B方向转录。猪的多条IFN．6基因位置夹杂在各IFN-a和IFN．03基因之间。鼠的Limitin两条基因位置相近，且氨基酸序列相似度很高，说明是进化中距今较近的基因复制的产物【4Ⅲ。Limitin作用尚在研究中，目前已把范围确定在抑制血细胞前体上【5，6，411。IFN．6被认为在生殖方面有着与IFN呵不同的作用【26’421。目前为止，Limitin功能基因只在鼠中发现，而IFN．6功能基因已在家猪，马，羊基因组中调取，并在其余多种动物的基因组数据库中发现【431，在大鼠，牛和基因组中存在着和它们同源的假基因，推测这一分支的I型干扰素也广泛的分布在真哺乳动物基因组中。Limitin和IFN．6在多种哺乳动物的基因组中并不存在，他们的功能被IFN一￡，IFN一旺，IFN—t，orIFN．∞等其他I型干扰素代替。有些研究认为，Limitin和IFN．5具有相同起源，应该算做是同种干扰素在不同动物中的表现形式。支持这种说法的论据有：它们的序列同源性高，进化处于同一分支，多个氨基酸的保守位点存在且仅存在于这个家族中，在其余家族中未有发现等等¨6|。还需要对此家族在更多动物中的数据补充和此家族功能方面的进一步研究，来为进一步分析这个问题提供支持[91。IFN—aco／IFN-a／IFN一(9／IFN—f(图1．2．)余下的一个大分支包括IFN．伍，IFN．(0，IFN．t等，至今为止发现，它们全部存在于真哺乳动物亚纲动物基因组中。这一支干扰素在基因组中的位置在多种动物中均聚集在IFN．p和IFN-￡之间靠近于IFN．p的位置，说明他们起源于此位置的同一个祖先【16J，如袋鼠中IFN．a类似蛋白。这支中首先分出的一个小亚群与IFN．0【和IFN．∞祖先有关，在犰狳，牛，猪和猫基因组中均具有含完整读码框的此类基因，这里将其称为IFN．0【∞。此基因在基因组上的位置紧挨着IFN．13，中间无其他干扰素基因插入。此类基因在猪和猫基因组中只存在一个拷贝，而在犰狳和牛基因组中存在多个19】。博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素GO及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究图1．2．IFN--ctco，1FN-a，WN．-co和IFN-T进化分析‘91。博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究l量1N一∞IFN．C0和IFN．T最终从IFN．c【中进化分支出来发生在各主要真哺乳动物类群进化分支之前。完整的IFN．∞基因在小鼠和大鼠的基因组中并没有发现，却存在于兔基因组中，说明功能IFN．∞基因确定起源于啮齿动物与其他主要哺乳动物类群进化分开不久。尽管在古灵长类当中，IFN．∞功能基因只有一个，存在于IFN．毡和IFN．B基因之间并与它们转录方向相同；但在许多非灵长类真哺乳动物中，却存在着多个IFN．CO功能基因重复，且散布在整个I型干扰素基因位点中。至于古灵长类当中，没有IFN．CO功能基因重复的原因仍有待进一步研究【9】IFN町IFN．t是由反刍类偶蹄动物胚胎滋养层分泌的一种I型干扰素，在胚胎最初着床阶段黄体的维持和胎儿与母体的相互识别中具有重要的作用【44，451。IFN．t基因只在反刍类偶蹄动物基因组中存在【46,47]，说明IFN．r和IFN．∞在进化上的分开起源于反刍类偶蹄动物与猪，河马，鲸等非反刍类偶蹄动物进化分开以后，约三千六百万年前。与此相一致的是，反刍动物IFN．CO是与IFN．t同源性最高的外类群。与偶蹄动物IFN．CO相似，IFN．f在牛，水牛，山羊，绵羊基因组中均以重复基因形式存在【91。IFN．a除犰狳外，IFN．俚在其他所有已研究过的真哺乳动物基因组中均有发现，且在基因组中的拷贝数要远远多于其他I型干扰素。0【干扰素在动物体内起着“卫士〞的作用，有着较高的抗病毒活性的同时也有着较高的细胞毒活性[2，48,9l。事实上，肿瘤细胞分泌的和经过人工改造的基因表达的IFN—a，具有更强的抗病毒活性。【5o，51】令人惊异的是，几乎每种动物中都有其特有的IFN．a亚型，结果造成除了同源性及其高的两个物种，如人和黑猩猩，小鼠和大鼠，人和水牛外，很难在不同种哺乳动物之间找出对应的各IFN．a亚型。1FN一0【基因是一类无内含子的多基因家族。人的IFN．c【基因有13个功能基因和1个假基因，由于有两个基因编码同一个蛋白，实际共有12个亚型，IFN．0【各亚型之间有约94％同源性：小鼠IFN．Ⅱ共有17个基因，其中包括3个假基因和14个功能亚型；猪的伍干扰素目前已发现14个功能基因和2个假基因【52】。I型干扰素在不同种动物和不同细胞系之间存在着种属特异性。这种特异性造成的不同种间作用障碍在某些I型干扰素种表达较为明显，如IFN．a，而某些那么没有很严的限制，如IFN．p。造成种属特异性的原因全部在于受体。将对应IFNARl，IFNAR2转入宿主细胞系可以消除种属特异性。此外，干扰素序列博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素∞及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究的突变某些情况下也可以消除种属特异性【2，48，491。有趣的是，某些动物干扰素受体可以与其远源动物的干扰素结合却不能与其亲缘关系较近动物的IFN作用(如人和鼠)，其原因仍未完全了解。尽管无论干扰素或是受体均在进化中有很大变异，但它们之间的结合位点却保守性相当强【531。结合区附近一个氨基酸的变异所造成的结构改变，就会使其完全失去结合力，这可能正是造成保守性强的原因。干扰素如受体的协同进化保证了同种内两者之间的相互作用，而不同种干扰素与受体间可以相互作用与否，可能只是偶然现象。二、I型干扰素的信号通路及lt．-与病毒的相互作用1．病毒诱导干扰素的产生上世纪60年代末到70年代以来对干扰素的诱导剂的研究发现，双链I埘A(dsRNA)，特别是Poly(I)Poly(c)是最有效的I型干扰素诱导剂【5引。Marcus等在70到80年代的研究发现，DNA病毒和RNA病毒均可通过产生病毒双链RNA来诱导干扰素的产生【55，56】。由于负链RNA病毒可在转录时形成双链RNA，正链RNA病毒可在复制时形成双链，甚至于DNA病毒，也会在集中转录时形成双链RNA，这就使得各种不同类型的病毒，均能在其某个阶段，诱导干扰素的表达【57J。双链RNA是有效的I型干扰素诱导剂，但却并非唯一的诱导剂。细胞可通过多种方式识别入侵的微生物，并且通过多种途径识别病毒。宿主通过模式识别受体(patternrecognitionreceptors，PRR)识别入侵的病原相关的分子模式(pathogen．associatedmolecularpatterns，PAMPs)，并诱导产生干扰素。病原相关的分子模式是模式识别受体(PRR)识别结合的配体，主要是指病原微生物外表某些共有的高度保守的分子结构，如G+菌的脂多糖，G一菌的寡肽糖和真菌的酵母多糖等；也包括宿主凋亡细胞外表某些共有的分子结构，如磷酯酰丝氨酸等。PAMP数量有限，但在病原微生物中分布广泛。病原体相关分子模式是存在于低等微生物或其细胞壁上的一些保守成分，由于这些成分不存在于高等哺乳动物中，藉此哺乳动物参与天然免疫的细胞可以区分出“自己〞与“非己"成分。Toll样受体(tolllikereceptor,TLR)是PAMPs的结合受体，不同的PAMPs可以被不同的Toll样受体所识别或组合识别，然后通过一系列蛋白质级联反响激活转录因子NF柚和Jun／Fos，从而有效地活化天然免疫系统。PAMPs作为一种天然的免疫佐剂在感染性疾病和肿瘤的防治中具有潜在的巨大的应用价值。最近发现细菌DNA，非甲基化CpG也是特征性的PAMPs分子。具体于在每一种情况下某条信号通路所起的作用，与入侵的病毒及其它微生物种类，被感染的细胞种类，感染的过程和程度都有关系，需要分具体情况来分卡斤157J。下面简述博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究两种病毒诱导干扰素的途径：1．1．经典途径：最经典的例子是在纤维原细胞中，用Poly(I)Poly(C)或者简单的RNA病毒，如仙台病毒(Sendaivirus，SeV)，新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)诱导干扰素p。这种诱导是在转录水平产生的，细胞中原有的信号分子和转录因子已能满足诱导的要求，不需要细胞中新的蛋白的参与【5dsRNA进入细胞后，细胞内的RNA解旋酶RIG一1(retinoicacidinduciblegene．1，视黄酸诱导基因1)，MDA5(melanomadifferentiation-associatedgene．5，黑色素瘤分化相关分子)可以检测到它们的存在。RIG．1和MDA5两者之间的作用并不重复，它们可以检测不同的病毒入侵【58’59】。dsRNA引起了RIG—l和MDA5的结构变化，使其可以与下游信号分子IPS．I／MAVS作用，将信号传递到定位在线粒体膜上的IPS．1／MAVS中。IPS．1／MAVS的下游信号还尚不明确，但的是，它们有活化IRF．3的作用【60，611。在经典途径中，诱导IFN．B需要NF榴和干扰素调节因子3(IFNregulatoryfactor．3，IRF．3)的参与。此外也有研究发现，10种IRF中的某些其它成员，在某些情况下可能也参与了此诱导过程【57'62,6扪。在发挥诱导作用之前，IRF．3和NF．rd3均存在于细胞质中，在接收到相应信号后，IRF．3的C端磷酸化，所引起结构变化使得IRF．3形成二聚体，进而使得一个细胞核定位信号(nuclear-localizationsignal，NLS)暴露[64-66]。在去磷酸化之前，IRF一3会持续不断地转位进入细胞核中[671。NF．KB在胞质中以与NF．1cB抑制因子(IKB)结合的形式存在。在病毒入侵后，信号分子使得Ir,B磷酸化，并随后泛素化，被蛋白酶体识别降解。没有了11(B的抑制，NF．rd3在p65位置上的细胞核定位信号暴露出来，并引导NF-rB入核168，691。入核之后，NF．1(B和lRF．3矛3c-jurdATF．2复合体以共同作用的形式作用于IFN—p基因的启动子上，这个大的复合体共同成为增强子(enhanceasome)。增强子的形成需要高迁移率族蛋白(highmobilitygroupprotein，HMG)中的染色质相关蛋I兰1(chromatin．associatedprotein，HMOI)的帮助【70】。通过增强子的作用，来诱导IFN．p基因的高效转录。此外，在某些研究中也发现，某些情况下，IRF．3可单独诱导IFN．p基因的表达，而不需NF．KB和c-jun／ATF．2的存在【71，721。因此，各相关转录因子在IFN．13诱导中所起的作用可能还需要根据细胞和诱导物的状况做具体分析。经过病毒诱导产生的干扰素可以进一步作用于细胞体上，从而活化另外的信号途径。研究说明，经病毒诱导产生的干扰素可以诱导三种新的转录因子IRF-I，IRF-7矛IHRF-9的表达。而由这些转录因子再进一步的起到诱导作用【73。——博士学位论文——博士学位论文家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究————————————————————————————————————————————二：：：：二=：：：=：=：：：：77]o这几种转录冈子各自具体作用尚不明确。除了在浆树突状细胞和经过干扰素处理过细胞中之外，IRF．7的表达水平在其它组织细胞中非常低甚至检测不到。据此推测，它可能通过正反响机制由初始表达干扰素(primaryIFN，又称立早型干扰素，immediateearlyIFN)诱导表达。立早型干扰素常见的包括人IFN．13，小鼠IFN．or4等等【78’79】。立早型干扰素通过与细胞外表受体的相互作用，诱导了IRF一7的表达，IRF一7可以继续促进立早型干扰素的表达，与此同时，它还活化了包括大局部的IFN．13．等的“后续〞干扰素的表达【76‘77,79J。IFN．0【的诱导不如IFN一13一样简单明了，其中很多机理性的东西尚不清楚。在成纤维细胞中，除了小鼠IFN．ct4，其余的IFN．Ⅱ均不属于病毒直接诱导表达的立早型干扰素。IFN．Q的启动子区域并没有NF．KB的结合位点，但是存在着很多个保守性并彳i是很强的IRF结合位点。具体是哪些IRF在其中起作用尚不是十清楚确。但有研究认为，IRF一7对于结合位点的序列特异性要求比拟低【801。且有证据说明IRF一7可以明显诱导IFN—d的表达，在IRF-7缺失的情况图1．3．病毒诱导干扰素表达的经典途径图示181．2．TLR途径：浆树突细胞(plasnlacyt。iddendriticcell，pDc)是人IFN—a的主要来源吲。细博士学位论文 博士学位论文 家猪T扰素u及8基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究胞通过Toll样受体(Toll．1ikereceptor，TLR)来识别通过内涵体进入细胞内的DNA病毒并[JRNA病毒184，851。人类pDC主要表达TLR7，TLR87币UTLR9。TLR7矛tlTLR8主要识别单链RNA病毒，而TLR9主要识别双链DNA的CpG富集区¨6|。TLR7，TLR8矛I]TLR9在活化后与受体MyD88作用，后者与TRAF6和IRF．7形成一个复合体，使得IRF一7被IRAK一1磷酸化。活化的IRF．7从转录水平上激活多种IFN一0【基因的表达(图1．4．)【86．871。pDC细胞区别于其他细胞的一个重要特征是它可以持续性的表达IRF一7。IRF一7并[JIRF一8可诱导干扰素的表达，同时又可以被干扰素作用正向调节，形成了一个正反响循环，从而促进IFN—et*HIFN．B的大量表达【61J。在近期的研究中，又发现pDC细胞的一个重要特征：与配体结合的TLR9(预!}!)!UTLR7／TLR8同样)可以在内涵体中维持很长时间的活性，而在其他细胞中，它们会很快的转入溶酶体中并降解【74】。由此，我tfJt包就可以理解为什么一些有着免疫抑制和破坏免疫平衡作用的病毒丰要作用J：pDC细胞上，来[jHNTLR．MyD88一IRF一7介导的干扰素诱导途径。在人类病毒中，较典犁的例子是麻疹病毒(measlesvirus)和呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialviruse)，具体机制还有待进一步研纠8剐。图l·4．浆树突细胞中病毒诱导干扰素表达的TLR途径图示16II。堕主堂笪笙文 堕主堂笪笙文 家猪干扰素u及8基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究————————————————————————————二二二二二二二_=二=：：：：==：．：：：=：：=：：2．I型干扰素作用信号通路作为一种分泌蛋白，干扰素通过与特定的蛋白外表受体结合，从而活化JAK—STAT信号通路。再由该信号通路的下游诱发抗病毒相关基因的表达(图1．5．)。I型干扰素的共同受体，又称作干扰素c【受体(IFN一0【receptor’IFNAR)，是一个由IFNARl和IFNAR2两个不同的穿膜蛋A组成的异源二聚体【16’89。911。在没有配体结合的状态下，IFNARI与Tyl(2结合，而IFNAR2与JAKI结合。I型干扰素可以与1FNARl和IFNAR2一起，在细胞外表形成一个多聚体。多聚体的形成使得两个受体蛋白的胞内局部结构发生变化，随之磷酸化下游信号分子Tyk，JAK和STATs【16’92。4I。比方说，Tyl(2可以磷酸化IFNARl的466位酪氨酸位点，从而形成一个可以有很强锚定STAT2作用的位点。随后，Tyk2磷酸化STAT2的690位酪氨酸，JAKl磷酸化STATl的701位酪氨酸，使得磷酸化的STATl和STAT2形成一个稳定的二聚体【6¨。STATl／STAT2随后又与干扰素调节因子9(IFNregulatoryfactor9，IRF一9)结合，形成一个转录复合体，称为干扰素基因活化因子3(IFN—stimulatedgenefactor3，ISGF31。ISGF3进入细胞核，与’li扰素诱导基因(interferon—stimulatedgenes，ISGs)转录调控区的干扰素活化因子反响原件(interferon·stimulatedresponseelement，ISRE)结合，启动这些基因的表达，从而到达抗病毒和免疫调节的效果(图1．5．)【96’971。此外，活化的STATI也可以形成同源二聚体，称为AAF复合体。AAFlq样可以进入细胞核，活化调控区为GAS反响原件的基凶的表达Ⅲ1。／＼馨一 学 ≥蓬雩p：：_一{一一≠一～～～团 围6 ⑩5，，。"-j：：；．一+、 T 图1．5．i型干扰素作用的JAK．STAT信号通路195‘。博士学位论文家猪!垫室竺墨!苎鬯窒鳖塑堑堡墨垫堕兰堕窒里婴茎二———一博士学位论文家猪!垫室竺墨!苎鬯窒鳖塑堑堡墨垫堕兰堕窒里婴茎二———一由于JAK．STAT信号通路存在于许多细胞冈子，趋化因子等的作用过程中，I型干扰素可通过激活JAK．STAT信号通路影响许多其他因子的作用，从而到达免疫调节的作用(图1．6．)[61,951。学学鐾 藿露器L———T———一瓢’、ln]：～〞‘j’11)[图1．6．IFN．q／p通过JAK．STAT信号通路的“通讯〞(crosstalk)作用诱导IFN．丫和IL．6等细胞因子表达。3．I型干扰素诱导的抗病毒基因及其作用用I型干扰素处理细胞会导致数百种基冈表达的上调，而干扰素的抗病毒和免疫调节作用，j巳已这些基因表达产物共同作用的结果。其中，几种典型的I型干扰素诱导基因的作用已有深入研究157·09I。卜-【旬选JLffIJ做具体说明：Mx蛋[刍(myxovirus．resistance)Mx家族基因表达人量的GTP酶相关动力蛋白，’EH'f]对于很多RNA病毒都有———————』生竖型塑垒墅—I塑￡壁塑生兰塑里窒鳖塑堑笙墨垫竺堡堕窒望堑壅着明显的抗病毒作用。Mx蛋白可以识别病毒的核衣壳结构并限制它们在细胞。fI———————』生竖型塑垒墅—I塑￡壁塑生兰塑里窒鳖塑堑笙墨垫竺堡堕窒望堑壅着明显的抗病毒作用。Mx蛋白可以识别病毒的核衣壳结构并限制它们在细胞。fI的定位，从而限制了病毒的复制。如图1．7．所示，在I型干扰素诱导之后，MxA基因表达。MxA蛋白在细胞质中的内膜，如内质网，上聚集，并通过他们的亮氨酸拉链结构相互作用形成～个低聚物。在病毒攻击时，MxA单体释放并与病毒核衣壳等结合，限制并降解病毒‘57_991。Trapped,,iralCdnDo∞ntS图1．7．MxA抗病毒作用机理199I。2’5’．寡腺苷酸合成酶(2’5一oligoadenylatesynthetase，2'5一OAS)OAS在通常情况下少量组成型表达，且为非活化状态。在I型干扰素诱导下，其表达量可大幅度增加。非活化状态的OAS以单体形式存在于细胞质中。在接收到病毒双链RNA信号活化后，OAS通过2’5’磷酸化链式反响使得ATP聚合，同时2’5’寡聚腺苷酸结合在RNA酶L(RNaseL)上使之二聚化活化。活化的RNA酶L可以降解细胞和病毒的RNA。因此，OAS／RNaseL的作用也可能会导J(图1．8．)。致细胞凋亡l蛋白激酶R(ProteinkinaseR，PKR)与OAS相似，PKR少量组成型表达，且为非活化状态。PKR可被I型干扰素诱导表达，诱导受其皋因调控区中的激酶保守序列(kinaseconservedsequence，KCS)和ISRE原件的控制。非活化状态的PKR一般以单体形式聚集在细胞核和细胞质中。PKR可被病毒复制过程中产生的双链RNA激活，同时一些其他分子，如神经酰胺，蛋白活化因子PACT(proteinactivatoroftheIFN·inducibleproteinkinase)等也有此作用。激活后的PKR磷酸化二聚化，可调摔多条细胞信号通路，具体调控机制还有待进一步研究。PKR现的一个与抗病毒有关的重要机制是通过磷酸化真核牛物转录起始因子elF2a来抑制转录(图1．9．)。此外，因为elF2a的磷酸化可以激活细胞的自我吞噬作用，所以PKR的1．9．)。此外，因为elF2a的磷酸化可以激活细胞的自我吞噬作用，所以PKR的作用还包括通过细胞凋亡和细胞周期阻滞来到达抗病毒效果【57’991。图1．8．OASI作用机理199I。oooo图1．9．PKR作用机理‘99I。博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素∞及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究4．病毒对干扰素作用的逃逸机制如上所述，干扰素可以“感应〞到各种DNA，RNA病毒的入侵，以正反响调节的方式大量表达，并通过诱导各种抗病毒基因的表达和活化免疫的作用发挥其抗病毒功能。因此，在长期的进化过程中，病毒也产生了一系列特有的机制来逃避或阻断干扰素作用。病毒对抗干扰素途径的作用形式是多种多样的，可以覆盖其整个过程，可以有多种机制。主要包括：(1)广范的干扰宿主细胞的基因表达和蛋白合成，如病毒编码的蛋白酶可切割转录起始因子elF4．G，poly(A)结合蛋白等；(2)通过减少表达PAMPs来减少对干扰素的诱导，或者特异性的阻断干扰素诱导链来减少干扰素的表达；(3)抑制干扰素信号通路，可以通过减少JAK／STAT分子的表达或者活化来进行，诱导信号抑制因子SOCS是其中一种方式；(4)阻断干扰素诱导的抗病毒因子的活化途径，如减少Mx，PKR，OAS的表达等。(5)病毒的复制机制可以最大程度的逃避干扰素活化机制等。如图1．10．所示，不同病毒会通过不同的作用机制，具体作用于干扰素整个从诱导表到达发挥作用的整个过程中的某个具体环节上p川。总之，I型干扰素家族随着生物的进化而不断的壮大，在哺乳动物中分支出多种功能特点各异的亚型。但l型干扰素发挥其抗病毒作用的主要信号通路是相似的。I型干扰素大多可被病毒和类似物诱导表达，通过结合于细胞外表的I型干扰素受体，激活下游的信号通路，从而活化抗病毒因子的表达，来起到抗病毒的作用。而病毒在长期的进化过程中，也产生了～系列特有的机制来对抗干扰素的作用。图1．10．病毒对干扰素作用的逃逸机制I图1．10．病毒对干扰素作用的逃逸机制I61I。图示各病毒和具体起作用的相关蛋白。各病毒简写如卜．(按照宁母顺序)：AdV,adenovirus；BDV,Bomadiseasevirus：BUNV,Bunyamweravirus；CSFV,classicalswinefevervirus；DHFV,Denguehemorrhagicfevervirus；EBOV,Ebolavirus；EBVEpstein—Barrvirus；FLUAV,influenzaAvirus；FLUBv’influenzaBvirus；HCV，HepatitisCvirus；HHV．8，humanherpesvirus8：HIV’humanimmunodeficiencyvirus；HPVl6，humanpapillomavirusl6：HPVI8，humanpapillomavirus18；HSV-l，herpessimplexvirusl；JEVJapaneseencephalitisvirus；PV,Poliovirus；RV,Rabiesvirus；RSV．respiratorysyncytialvirus；RVFV,Riftvalleyfevervirus；THOV,Thogotovirus；TMEV,Theiler’Smen?ngoencephalitisvirus；VVVacciniavirus；VSKvesicularstomatitisvirus；WNV,WestNlievirus；YFV'YeIIowfevervirus。22博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究第二章猪繁殖与呼吸综合症研究进展摘要：猪繁殖与呼吸综合症俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PPRSV)引起的一种传染性疾病。蓝耳病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，其危害已几乎遍极世界所有养猪国家。本文简述了猪繁殖与呼吸综合症的流行与危害，PRRSV病毒分类，蛋白结构功能，作用方式及特点等。由于PRRSV病毒作用过程中有强烈的免疫抑制作用，PRRSV的抗病毒药物和疫苗的研究一直是一个难题。我们从免疫和疫苗的角度分析了PRRSV病毒的免疫特点，PRRSV疫苗及存在的问题，PRRSV疫苗佐剂研究的进展等。最后，我们简要表达了2023．2023在我国等亚洲国家大爆发的高致病性猪蓝耳病及其特点。关键词：猪繁殖与呼吸综合症，猪繁殖与呼吸综合症病毒，免疫，疫苗，佐剂中图分类号：Q78TheThesummaryofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromeAbstract：Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isalsocalled“￡lJcbldisease〞，isakindofinfectiousdiseasecausedbyPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(F'RRSV)．PRRSVgenerallycausesrespiratoryfailureinneonatesandabortiominSOWS．Inthispart，wesummarizedtheepidemicandharmofthedisease；thelype，genestructure，protehafuclionandpathogenesisofthevirus．AsPRRSVpresentstrongimmanesuppressioneffect，safeandeffectivevaccineshaveyet幻bedevelopedandimplemented．Weanalyzedtheimmunityandviralpersistenceofthevirus，andfurtherdiscussedthecurrentvaccine，adjuvantsofPRRSV,andtheproblemsindevelopingsafeandeffectivevaccines．Keywords：PRRs，PRRSV,immuAe，vaccine，a6juvant博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素6d及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究一、猪繁殖与呼吸综合症与猪繁殖与呼吸综合症病毒1．猪繁殖与呼吸综合症的流行与危害猪繁殖与呼吸综合症俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PPRSV)引起的一种传染性疾病。PRRSV易感动物为猪，不分性别、大小皆易感染，但以妊娠母猪以及一日龄内的仔猪最易感染，感染后那么会出现典型的临床病症。以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。患病猪和带病猪是蓝耳病的主要传染源。蓝耳病其危害己几乎遍极世界所有养猪国家【100，101】，【1021。美国的一份统计显示，每年由蓝耳病造成的经济损失到达5亿6千万美元【102J。2．PRRSV病毒分类，基因及蛋白结构功能PRRSV属于属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属[1031，PRRSV从进化和病毒结构上大致分为北美型和欧洲型两个大类(图2．1．)。这两个大类之间基因水平上大约有40％的同源性。他们之间存在血清学的差异u041。canac妇￡W潮持图2．1．PRRSV病毒的分类‘加5】PRRSV的遗传物质是单链正链的RNA，约有15．0kb，含有九个开放性阅读框(ORFs)[106】。其RNA的结构与马动脉炎病毒(equinearteritisvirus，EAV)，猴出血热病毒(simianhemorrhagicfevervirus，SHFV)等其他动脉病毒(arterivirus)相似。例如：单链RNA的5’端被甲基化，3’端为多聚A的尾巴等。PRRSV的基因组具有多个顺反子，其中包括两个较大的ORF(ORFla和b)以及lb基因片段下游的六到九组ORF。ORFIa和ORFIb大约占了病毒基因组的75％，它们编码着两个较大的多聚蛋白，即复制酶蛋白ppla和pplab。它们在翻译的过程中或翻译完成后被蛋白酶切开为14个非结构蛋白。这些非结构蛋白多数参与基因组的复制以及mRNA的转录。目前，我们对PRRSV非结构蛋博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究白的生物学作用依然了解甚少，只知道它们呈现一定的复制酶、蛋白酶以及多聚酶活性。ORF2．7编码的PRRSV结构蛋白是由6个亚基因组的mRNA表达的。这些mRNA具有3’末端成环结构，同时在5’端拥有相同的前导序列。ORF2a，ORF2b和ORF3-7分别编码结构蛋白GP2a，GP2b(E)，GP3，GP4，GP5，M和N【107】。GP2b的ORF完全镶嵌在ORF2中。GP2a，GP3和GP4都是N．糖基化的微量包膜蛋白，它们可能通过二硫键形成异源三聚体11岘’108]oGP5和M蛋白是动脉病毒中的两大重要包膜蛋白，它们以二硫键相连的异源二聚体形式存在于病毒体内(图2．2．)。这些异源二聚体于内质网(ER)中形成。无糖基化的M蛋白是动脉病毒中最保守的结构蛋白。一些推测认为该蛋白近N端的一半氨基酸链跨膜三次，只留下10．18个氨基酸暴露于病毒的外表。GP5蛋白在其N端处可能存在一段信号序列，在该处被截断后，留下一段30个残基长的外部结构域。GP5蛋白与M蛋白有一些类似，其中间段的疏水性片段也跨膜三次，其后连接一段位于细胞质的，由50．72个氨基酸残基构成的结构域。研究显示，M和GP5蛋白的异源二聚化对于组装包膜的过程十分重要，因此也影响着病毒的传染性。由ORF7编码的核壳体蛋白是病毒体最丰富且最富免疫原性的蛋白，以二聚体的形式存在【1啷J。13前，可以通过cDNA克隆的方法改变PRRSV局部基因组，来构建PRRSV突变体。但是由于PRRSV基因相重叠的特点，所以想要只改变一个基因而不影响相重叠的其他基因依然十分困难。由反向遗传系统组建的PRRSV突变体的各种特征显示PRRSV的所有结构蛋白在病毒的复制过程中均不可或缺【¨们。PRRSV与许多其他动脉病毒类似，对于结构蛋白微小的突变异常敏感(无论是缺失还是插入)[1lll。例如，N蛋白C端处的局部人工的缺失即会影响病毒的毒力〞垃】。另一方面，病毒基因组天然多态性说明PRRSV对于自然变异的容忍限度还是较大的。实验证明，在基因组的ORFlb以及ORF2a框架中间有插入片段的突变体能够存活，且病毒滴度高，在扩增过程中可以保持稳定表型，这说明异源序列在该处可以被引入Il¨J。Nsp2区域也可以容许较大的缺失或是插入。Yu等人的研究将处于ORF5／6和OI心6／7前端和末端的相重叠基因序列别离。这项研究显示回复突变的病毒与原毒株拥有相似的生长动力机制、抗原性等【102，11关于PRRSV病毒复制及致病机理方面的研究还处于起步阶段。据推测N蛋白，M蛋白和GP5蛋白在病毒颗粒组装中起重要作用，且单纯这三个蛋白即可完成病毒颗粒组装。但是其它辅助性蛋白在病毒感染细胞过程中均会起到作用f102，108,114]。研究说明，非结构蛋白nspl的蛋白水解区域对于病毒的基因复制和mRNA合成不可或缺【11博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究Membrane．boundImmunomoduIator$sw／图2．2．PRRSV病毒结构(AlyssaHaak，VirginiaTech)3．PRRSV作用方式及其特点PRRSV病毒可通过多种途径侵入，主要感染来自肺泡的巨噬细胞。体外培养的PRRSV能够在肺泡巨噬细胞的根底培养基中生长【116J。此外，该病毒还能感染其他单核细胞，特别是肺血管内巨噬细胞，淋巴腺和脾脏的巨噬细胞以及胎盘和脐带血管内巨噬细胞71。PRRSV并不在未活化的巨噬细胞里复制，但是哪条分子途径的激活能够维持病毒的复制至今尚无研究结论引。IFN．q，因其可以在体外培养的单核细胞中卜调唾液酸黏着素的表达，不仅起不到抗病毒作用，反而可以促进PRRSV病毒对单核细胞的感染9l。在感染的初期，PRRSV利用硫酸乙酰肝素结合于肺泡巨噬细胞。这个结合作用与病毒M蛋白和GP5蛋白密切相关，所以这两种蛋白可以用于PRRSV多肽疫苗的研究91。随后，更多的病毒体陆续与猪唾液酸粘附素(PoSn)相互作用并通过PoSn辅助它们运输到细胞内【陀01。在病毒体去壳的过程中，PoSn可能与CDl63共同作用。多数无PoSn表达或微量表达的未活化巨噬细胞不被PRRSV感染。这说明PoSn在PRRSV的感染中应扮演着十分重要的角色。PRRSV转移入细胞后蛋白酶那么开始分解其外壳Il川J。被PRRSV感染的猪会有一个较长的时期可检出病毒血症，并且可以传播病毒。佣是病毒并不会进入潜伏期，而是在扁桃腺、肺部和淋巴系统不停地扩增【122l。该阶段在产后感染的猪仔中可长达150天，而在通过母婴传播感染蓝耳病的猪仔那么可达210天。PRRSV的突变往往出现在这个阶段，但驱使它们出现的选择压力还不能确定，病毒持续复制的机制也尚不清划10细胞凋TL=是高致病性蓝耳病的一个典型病症。但是相关的病毒基因序列、博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素u及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究机制以及细胞凋亡的结果都尚不清楚。奇怪的是细胞凋亡不仅出现在PRRSV感染的细胞中，还出现在未感染的相邻细胞中。在这些未感染细胞的细胞凋亡的前期，可检出GP5和TNF—c【等细胞凋亡炎症因子[123】。值得探讨的是病毒量与发病程度并没有直接的相关性。二、PRRSV免疫特点及疫苗研究进展1．PRRSV病毒与机体免疫PRRSV的感染一个重要特征是会导致肺部被感染的细胞无法表达关键的炎症细胞因子，特别是1型干扰素，IL一1，TNF．Ⅱ等[124]。研究说明在巨噬细胞和树突状细胞中，PRRSV可以诱导IFN．B，却无法诱导IFN_0【。因为IFN．o【具有广泛的抗病毒作用，且已有研究证明，它有抗PRRSV的作用，所以阻断IFN·0【的表达在PRRSV的作用中可能是比拟关键的环节[125】。且由于IFN．c【本身具有促进获得性免疫的作用，PRRSV对其的阻断会同时影响到获得性免疫。病毒灭活之后失去阻断IFN．0l作用，但具体参与此作用的蛋白目前还尚不明确。PRRSV还可以感染DC细胞和巨噬细胞。PRRSV的感染会导致DC细胞的凋亡，减少CDll，CDl4，CD80／86及MHC等免疫表位的表达，减少细胞的活化，上调IL．10。IL．12和TNF．0【的表达等。此外，PRRSV可以延迟NK细胞的活化，延迟中和抗体的产生，白细胞的增殖和IFN一丫的表达等¨02'1261。总之，PRRSV通过调节DC细胞和巨噬细胞的细胞因子表达和改变参与抗原递呈的蛋白表达来抑制机体的自体免疫和获得性免疫。这导致病毒进入机体后，很难激发起足够的免疫反响，从而延长了病毒在体内存在的时间L1嘲。此外，病毒还通过多种机制到达其抑制免疫和免疫逃逸的效果(表2．1．)。2．PRRSV疫苗及相关问题PRRSV的减毒活疫苗和灭活苗已经被批准可以应用。减毒活疫苗已被广泛运用，它对于降低疾病的爆发和大面积传播都有一定的效果，同时能减少已发病动物的发病时间以及阻碍病毒的装配。减毒活疫苗所提供的预防作用比灭活苗更为有效，但只是在同源病毒的情况下才会效果显著。在一些国家，只允许在繁殖动物时运用PRRSV灭活疫苗。一些灭活苗是专门为降低由PRRSV引起的生殖障碍而设计(表2．2)。疫苗的免疫效果及免疫效率通常来说，PRRSV减毒疫苗(MLV)对于同源毒株感染能够提供有效的免疫，但是目前的疫苗没有一个能够完全预防PRRSV的呼吸系统感染，母婴传播以及猪与猪之问的病毒交叉感染。例女lOsofio等人的研究中将三个已上市的疫苗预博士学位论文 博士学位论文 家猪干扰素口及6基因家族的特征及抗蓝耳病应用研究防高致病性PRRSV的能力作比拟，发现这些疫苗对于减轻发病病症有效，但对预防感染没有作用【12刀。有更多证据说明目前的疫苗，对预防异源病毒引起的感染根本无效。此外，减毒疫苗也很难维持母猪对于病毒的免疫。Cano等人研究了治疗性减毒疫苗对于已感染蓝耳病的猪的发病持续时间和散毒能力的影响。研究说明，该疫苗并没有消除已有的PtLRSV，但是它显著地减少了同源病毒对其他猪的感染，而对于异源病毒无明显作用【1161。而灭活病毒疫苗甚至对于同源病毒效果都很不理想(http：／／www．cvm．uiuc．edu／news／PRRSwhitepaper．pdf)。总的来说，目前还缺乏可靠有效的疫苗佐剂来提高灭活疫苗作用。平安性关于减毒疫苗毒性返强已经有数起报道。减毒疫苗的多变性使人们对于它的平安性提出质疑。一项流行病学调查显示：在丹麦，由于未感染的猪中，减毒疫苗的毒性返强而曾经导致了PRRSV的又一次流行B28]。别离野生毒株的基因型和表型特征显示该病毒的返强并不是偶然事件。此外，疫苗的病毒和野生型病毒在基因水平上很难区别，这也为临床PRRS的检测制造了困难。Mengiling等人标记了一个专门在疫苗毒株VR2332出现的保守位点，并通过此标记来研究注射减毒疫苗的流行病学影响。研究显示，在注射该疫苗后，别离的25个流行毒株中的24个都显示含有该序列。更有甚者，这些疑似疫苗来源的毒株与用来制造减毒疫苗的原毒株相比，存在显著的病理学变化u列J。总之，现有的蓝耳病疫苗无论是在有效性还是平安性上，都存在着缺乏，更为平安有效的疫苗还有待进一步研究。3．PRRSV疫苗佐剂研究由于PRRSV疫苗的效果并未到达理想程度，对于疫苗佐剂的研究就变得十分必要。为提高疫苗的细胞免疫和体液免疫作用，在之前的研究中尝试了许多种佐剂，其中包括细胞因子，化学试剂，细菌产物等等。由表2．3．可见，己尝试过的疫苗佐剂中，IL一2，IL一12，IFN．旺，polyIC，andCpGODN这5种有明显的活化细胞免疫的作用。CpGODN和CT两种有明显活化细胞免疫的作用。IL-2和CpG两种具有明显的减少动物病毒血症，减少肺部病症和提高动物保护率的作用。综上：仅有cpG一种可以同时到达三种效果【1301。更加平安有效的疫苗佐剂还需要进一步的研究。口翟口翟 -K：姆增替林【9lI交跫武埝．翟肇【I￡I．焉_【一 爵曼氐趁 【￡￡王氐世 蛙蔓 世墨 武蕊．翟蝗一nn_I．n￡I一温皿随价d。 ．nnZ趟。0皿昭艚惧岬媳 ．皿随Z迥群皿 皿嘲Z 0c0锚四翟。 ．寸寸Z墓疑回Zon眯嘏票怕蠖躁嬉眯蔌艚螓熏呔靛螺帐臻氓图转．趟岖m困星暴蜞粼氐堪蜒氓趔靶糕蹄熔娶甚蜒毒姑制趟限蒹器葚堰辎媳限盈暴球馋柩濮篷蛊蹄畚基 ．罂疑h冥忡函惧粼器卜．。-【●H器叫州测隧蟮警遨鲁然晕}长基蚶擀曝．那么辖遵呕跫辖黑哥最罂垦 价d。螓莨蛞堰黑廿警鞋．矧辖毯岖葚辗黑七b ．。nZ厘玺然靶坟簿趟艚螓．魈镄搭最器譬擀口R辫．3／DH妙HH／I器暴舞恻函醐．愀球暴型 留卿咿妲?蚕∞刁辗巾 埝埔长恒冥区咚长惮罨璺巢皿随储馔 翟器<斟黼堠蹄太日甚辖 HQo器卜。U熙星器uQ o}{窆．∞∞／0∞Qu．!Qu 逍搽熏廿螓遐 淫噬堪悄黑d]萝巴器暴嫂缀燃氓>∞告密．I．N僻瞥斌嫂魁锹粼意烂-N旨七b露焉智删箍量器幂暖警苎旧僻型器S球餐柩惮趔蝶g皿嘲伸惧氐誊 辫辖坩螓星蹄畚葚堰 隧辗温壁器uQ唇缺州毅 逍懈髻 橙哒甚醐磐邋僻娶子 矧困醐艚倏岛镁鼎龌耸锹粼水罂唰K蛊碌世蟮皿米票罨地对蒸1丑。枣烂。蜕蹬垦燃悼蹬垦燃悼醐艚爆．器霉恃累恤旺世葚咏．I槭赳、似毽篮裢霸函恒裂姑忙R媪氧账举裂．N叫匿q匿．I困醐聪武<擐齄氓樱?号懈倏．z碌器埝1裁靶忙．￡q匿．寸 叫匿 景长咪较 叫匠．I涩口k．z 粗越鞠剐尽?怅遥．I粗蜒黛剐筌越伥涩文龌口k．￡ 窿卿怒靛忖紧．景怅函醐米罢．I ．悄牲似恒裂姑蜒R龊辍送葚取．z瞍厘糖燃口亡b撼器粗谜 罨世U赆裂幂笾桓P．七b粗艚堪．一粗蜒K镫粗憾葚搽式 累世水婴篷柽舔世水票笾栏．I困醐m函暮导<耀．N幂巡其一粗蜒K镫粗蜒葚柩．寸 蕨性水罢篮挺燕世水罂^划甚v篮挺最世水巽篮檀．I扑_窳倏越藿妖崩鲁匣g越氓蜒菸柑粗蜒心越哒水罂剥茸懈煨嚣蚺卜旺世卷LI堕粗诞．I巽辙嫂诞妖嘏搿茁匣g蜒氓烬菸挂粗嵌式 储爆笾蜒世晕．n困粥水娶扑斟烬篮艇．景罂越罂剃餐．I隈蜮氓捌态．淞粗姆K镫粗镂葚柩．N世嫂嫉燃嘏岬器器 水忙罨晕蜒嘏岬镫．器器k 叫冥辎斟g旺世州裂隧辖忙挂函避再枢鲤过器斌S导甓愚智旺世暴辕件 器墨佟癯 甚醐纂。Z 景长 ‘Ⅱ嫩长旺世甚划最长旺 旺世嫩娥?皿冒l】^零穴粗擀餐蜜职她村群态v燃丧卷襞客箍口冥敞厘容葡璎避粗髅净琶厶．z．N僻 龋星惮悼 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