TCALAS 90-2020 实验动物 小鼠肝炎病毒逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法

ICS65.020.30B44中国实验动物学会团体标准T/CALAS90—2020实验动物 小鼠肝炎病毒逆转录-环检测方法Laboratoryanimal-Detectionofmousehepatitisvirusbyreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassay2020-12-01 发布 2021-01-01 实施中国实验动物学会 发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本文件主要起草人：周洁、陶凌云、于海波、陈洪岩、李昌文。鏈鏈鏈鏈实验动物 小鼠肝炎病毒逆转录-环介导等扩增（RT-LAMP）检测方法范围本文件规定了实验动物小鼠肝炎病毒（MHV）RT-LAMP检测的原理、方法和结果判定。本文件适用于实验小鼠肝炎病毒的检测。规范性引用文件本文件无规范性引用文件。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1逆转录-环介导等温扩增法reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification（RT-LAMP）逆转录-4～6DNAAMV逆转录酶的混合溶液1h内完成核酸扩增反应的一种特异、高效、可视化的链取代核酸扩增技术。基本原理DNA在65℃左右处于动态平衡状态，利用可以产生环状结构的引物和酶溶液（BstDNAAMV逆转录酶的混合溶液程中产生焦磷酸镁沉淀与荧光染料结合产生的绿色荧光判定反应结果。主要试剂和器材试剂RNA提取试剂盒。脱氧核糖核酸环介导等温扩增试剂盒。环介导等温扩增荧光目视检测试剂。器材水浴锅。116116第三篇实验动物检测方法系列标准环介导等温扩增反应管。生物安全柜。组织匀浆机。检测方法空白对照DEPC去离子水。阴性对照提取不含小鼠肝炎病毒的样本RNA作为阴性对照。阳性对照提取小鼠肝炎病毒的RNA作为阳性对照。引物F3：5′-AAGCAGTTCCAACCAGCG-3′B3：5′-TGGGCACTGCTTGTTTGG-3′FIP：5′-GGCCGGCATCTTTACCGAGCAAAACCTGATATGGCCGAAGA-3′BIP：5′-GCAAGTAACGAAGCAAAGTGCCAGTCCTCTTTTGGCGAGGC-3′LF：5′-TTAGCCAAAACAAGAGCAGCA-3′样品的制备1.0g2mL0.1mol/LpH7.2～7.6的磷酸盐缓冲液（PBS），12000r/min5min，取上清，用病毒RNARNARNA浓度进入下一步骤或–80℃保存备用。核酸扩增在反应管中配制25μL反应体系，见表1。表1小鼠肝炎病毒RT-LAMP反应体系反应组分 反应量2×反应缓冲液（RM） 12.5μLFIP引物 40pmol（1μL）BIP引物 40pmol（1μL）F3引物 5pmol（1μL）B3引物 5pmol（1μL）酶溶液（EM） 1μLDEPC去离子水 1.5μL样本RNA 5μL荧光染料FDR 1μL65℃恒温下反应60min。实验动物小鼠肝炎病毒逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法实验动物小鼠肝炎病毒逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法117结果