高效液相色谱法 (2)课件

高效液相色谱法

HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱仪分析流程仿真系统

高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6小结习题及解答一、概述高效液相色谱法：以经典液相色谱为基础，在气相色谱的理论和实验方法基础上建立的一种分离分析方法。简称：HPLC；HRLC；SPLC；UPLC

超高效液相色谱（UltraPerformanceLiquidChromatography）与经典LC相比——高效

高效填料：3～5μm

高压泵输液

高灵敏度的检测器:在线检测一、概述HPLC仪器示意图一、概述Agilent1100一、概述HPLC仪器图SHIMADZUAGILENTWATERS高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6二、基本原理范氏方程（VanDeemterequation)：重要

GC：填充柱

H=A+B/u+Cu

开口毛细管柱

H=B/u+Cu

HPLC：

H=A+Cu

原因：T↓；η↑；u↑→

忽略B/u二、基本原理GC和HPLC的H-u图(1)B/u(2)Cu(3)A(4)HPLC的uopt

(5)GC的uopt高效液相色谱法概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法（LSC）

1液液分配色谱法（LLC）2化学键合相色谱法（BPC）3三、各类高效液相色谱法液固吸附色谱法分离机理:组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面活性中心固定相:硅胶流动相:底剂（烷烃）+极性调节剂出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱例如：TLC三、各类高效液相色谱法化学键合相色谱法(bondedphasechromatography，BPC)概念：固定液的官能团通过化学反应键合在载体表面

反相键合相离子抑制正相键合相离子对三、各类高效液相色谱法反相键合相色谱法(RBPC)分离机制：疏溶剂理论等固定相：非极性的键合相 如:十八烷基硅烷键合相（ODS；C18柱)流动相：极性大的流动相 如:甲醇-水或乙腈-水流动相极性与k的关系:

极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑

极性大的组分先出柱应用：非极性--中等极性组分(80%)三、各类高效液相色谱法2.

正相键合相色谱法(NBPC)分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用力的差别固定相：极性大的氰基或氨基键合相流动相：极性小的底剂（烷烃）+极性调节剂

流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓

结构相近组分，极性大的组分后出柱三、各类高效液相色谱法常用离子对试剂：

分析对象离子对试剂例如碱烷基磺酸钠C5、C6、C7、C8磺酸钠,SDS酸四丁基季铵盐四丁基胺磷酸盐（TBA）三、各类高效液相色谱法4.

离子抑制色谱法(ISC)分离机制：通过调节流动相的pH，抑制组分离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸，弱碱的目的适用范围：3.0≤pKa≤7.0的弱酸

7.0≤pKa≤8.0的弱碱抑制剂:

弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6四、固定相化学键合相特点：不易流失；热稳定性好；化学性能稳定载样量大；适于梯度洗脱分类：非极性键合相：ODS中等极性键合相：醚基键合相极性键合相：氨基、氯基键合相四、固定相非极性键合相：ODS载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。其大小，决定键合相是分配还是吸附占主导作用。键合基团键长：键长↑，载样量↑，k↑五、流动相正相洗脱 流动相的极性小于固定相的洗脱反相洗脱 流动相的极性大于固定相的洗脱洗脱方式：等度洗脱(isocraticelution)恒定配比的溶剂系统洗脱梯度洗脱(gradientelution)在一个分析周期内不断改变流动相的比例五、流动相HPLC概述1基本原理2各类高效液相色谱法3固定相4流动相5高效液相色谱仪6六、高效液相色谱仪输液泵进样器色谱柱检测器工作站高效液相色谱仪HPLC六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站泵： 恒压泵 恒流泵:柱塞往复泵六、高效液相色谱仪Agilent二元泵示意图六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站色谱柱：由柱管(不锈钢管)和固定相组成分析柱 φ2-4.6mm L10-25cm

常量柱

φ1-1.5mm L10-20cm

常微量柱制备柱 φ20-50mm L3-25cm

六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站检测器:紫外检测器荧光检测器蒸发光散射检测器其它检测器六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站六、高效液相色谱仪T/min波长(nm)色谱－光谱图六、高效液相色谱仪输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站2489UVD2414RID2424ELSD2465ECDWATERSWATERS六、高效液相色谱仪超高效液相色谱仪()小结熟悉掌握了解HPLC的特点.HPLC的仪器结构及各部件.HPLC中色谱条件的选择.化学键合相色谱法.范氏方程在HPLC的表达形式.分离度影响因素正相色谱和反相色谱.习题及解答3.HPLC流动相的pH值应控制为___________

小于H=A+Cu2-81.反相色谱中固定相的极性

流动相的极性.2.HPLC中范氏方程的表达式为:

____________________填空题：习题及解答1.键合相的键合基团的碳链长度增长后(

)A.极性减少B.极性增大C.载样量增大D.载样量减少2.提高色谱柱柱效的可行方法是()A.选择小粒度的固定相B.降低固定相的粒度分布C.选择球形固定相D.匀浆装柱E.增加柱长F.选择适宜流动相G.降低流速ACABCD选择题：习题及解答计算题：1.用15cm长的ODS柱分离两个组分，已知在实验条件下柱效n=2.84×104m-1，用苯磺酸溶液测得死时间