蛋白质组学研究方法

第二章蛋白质组学研究方法1*当前1页，总共26页。

第一节概述

2*当前2页，总共26页。

1.

蛋白质组学比基因组学研究复杂蛋白质数目大于基因组数目，人类基因万左右，蛋白质﹥10万蛋白质是动态的4种核苷酸-DNA;20氨基酸-蛋白质蛋白质不能用PCR扩增蛋白质不能自动化测序3*当前3页，总共26页。DNA分析（cDNAMicroarray）与蛋白质分析（2-DE-MS）方法的比较DNA蛋白质检测水平/灵敏度DNA可用PCR扩增蛋白质无法被扩增检测极限约为30copy/transcript检测方法高度特异性非特异性DNA与互补DNA/RNA的杂交能力蛋白质可以用非特异的方法染色或用较特异使DNA和容易固定化在靶上并用的方法如抗体检测荧光探针检测，可用高密度列阵荧光扫描仪分子的稳定相DNA是非常稳定的，即使提高温度蛋白质在变性下将丧失天然功能下也不失去生物活性重复性重复性好重复性不好将DNA固定化在表面已经是成熟的由于蛋白质分子的稳定性不好，方法的重复性技术，加之DNA有固有的稳定性，方需格外关注法的重复性较好消耗初始的投入较大，但短期内得到的目前蛋白质分析方法依赖昂贵的仪器设备的数据相当大专业化方法已经相当标准分析较难，大部分工作需受过专门训练的人来操作时间/自动化已成为高通量的扫面技术目前还达不到工业化需求的高通量翻译后修饰无法研究只能用此方法研究动态5个数量级7-12个数量级4*当前4页，总共26页。

蛋白质分析技术的发展2D,IPG,2D-液相色谱图像分析与数据处理技术生物质谱技术（MALDI-TOF-MS,ESI-MS)MudPIT（多维蛋白质鉴定技术）ICAT（同位素编码亲和标签技术）双色荧光技术酵母双杂交Proteinchip5*当前5页，总共26页。

样品组织、细胞、体液胶上原位酶切2-DEMALD/TOF/MS肽指纹图谱蛋白质鉴定ESI/MS/MSPST/MALD/TOF/MS图像分析，数据处理电转印到膜上氨基酸组成N端序列Edman降解氨基酸分析肽混合物肽序列标签数据库检索免疫组化蛋白定位蛋白组数据库寡核苷酸合成基因蛋白实验蛋白活力肽合成抗体蛋白质组学分析流程6*当前6页，总共26页。第二节大规模的蛋白质分离技术7*当前7页，总共26页。一、二维凝胶电泳技术（2D)IEForIPGSDS8*当前8页，总共26页。1975年由O’Farrell提出的。是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量将蛋白质分离开。20世纪80年代初出现固相化pH梯度（IPG)(第一相等点聚焦）。不足之处：膜蛋白，碱性蛋白，低丰度蛋白分离困难。

解决办法？9*当前9页，总共26页。低丰度蛋白：窄范围pH,加大上样量，除去高丰度蛋白。BeforeAfterremovalOfalbumin10*当前10页，总共26页。2-DEanalysisofnon-fractionatedsoybeanleafproteins(Left)andCa2+/phytatefractionatedsoybeanleafproteins(Right).(Krishnanetal.

(ArapidmethodfordepletionofRubiscofromsoybean(Glycinemax)

leafforproteomicanalysisoflowerabundanceproteins

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Phytochem.2009)11*当前11页，总共26页。PEGfractionation:(A)1-DSDSofunfractionatedandfractionatedsamples;(B)2-DEPAGEmapsof‘‘Total’’extractedproteins;(C–E)2-DEmapsofPEGfractions:(C)F1PEGfraction;(D)F2PEGfraction;(E)F3PEGfraction.Electrophoresis2009,30,1594–160212*当前12页，总共26页。膜蛋白：分步提取法。CHAPS:zwitterionicdetergentCA:carrierampholyteTBP:TributylphosphineSB3-10:sulfobetaine(detergent)13*当前13页，总共26页。pH4 pH5pH5 pH6pH4 pH9碱性蛋白：扩大pH范围（IPGpH12)14*当前14页，总共26页。

高通量与自动化2D/MS为基础的蛋白质组技术体系自动化主要集中在2D后的样品处理。15*当前15页，总共26页。蛋白质识别系统的自动化2-DE,染色，凝胶分析胶上蛋白质自动切割置于96或384孔板自动蛋白酶解，多肽可回收，点样于MS样品靶自动MS样品分析自动采集数据数据库检索，蛋白鉴定16*当前16页，总共26页。1.实验设计，采样量2.重复性问题3.动态范围4.蛋白质的丢失5.通量与自动化问题2D质谱为基础的蛋白质组学方法的局限性17*当前17页，总共26页。二、色谱—质谱技术1．二维色谱—串联质谱技术（2D-HPLC-MS-MS)18*当前18页，总共26页。19*当前19页，总共26页。2-DE与2D-HPLC的比较优点缺点2-DE

分辨率高，﹥1000费时，费力可得到等电点、分子量的信息不已自动化可得到蛋白质表达谱疏水、酸性、碱性、﹤10kDa、

可平行多个胶﹥1000kDa的蛋白质易丢失

样品载样量受限制2D-HPLC

可分离各种蛋白质尚未实现平行操作易于自动化不易得到蛋白质表达谱样品在液相分辨率不高流分易收集可做样品制备和收集20*当前20页，总共26页。采用二维色谱—串联质谱技术可以对蛋白质混合物进行直接分离与鉴定21*当前21页，总共26页。2．同位素标记—亲和色谱—质谱技术定量蛋白质组学分析技术Isotope-codedaffinitytag(ICAT)22*当前22页，总共26页。三、一维电泳(色谱)—质谱技术23*当前23页，总共26页。

1886年Goldstein发明早期质谱仪的离子源，1942年第一台商品化质谱仪出现——分析小分子化合物。20世纪80年代末期的两项软电离质谱技术—电喷雾电离质谱（ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)——分析蛋白质。第三节生物质谱蛋白质鉴定技术MALDI-TOF-MS:高通量，肽指纹图谱，须数据库匹配。ESI-MS:肽序列标签，特异性高，混合肽测定，操作繁琐。新生物质谱技术:MALDIQqTOF-MS,MALDI–TOF-TOF-MS24*当前24页，总共26页。

Gel-basedproteomicsThetypicalflowofgel-basedproteomics(2DE&MS)Sample