猪胃蛋白酶原 A 基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究

猪胃蛋白酶原A基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究摘要天冬氨酸蛋白酶一般被称为酸性蛋白酶，在酸性条件下可催化水解蛋白质，是目前重要的工业用酶之一。胃蛋白酶属于天冬氨酸家族，是研究蛋白质结构与功能关系的重要模型。胃蛋白酶广泛存在于脊椎动物胃液中。胃蛋白酶经济价值高，用途广泛，胃蛋白酶在制革、方便食品、奶、口香糖加工制造等行业也有一定的用处。目前，商业、医药途径获得的胃蛋白酶主要从动物胃组织中提取，受动物脏器资源的限制，胃蛋白酶价格较高;容易残留一些动物自身的蛋白酶类，如一些组织蛋白酶等。而微生物反应器具有效率高效，操作简单，能够降低成本等优点，所以，通过筛选微生物反应器，然后规模化生产胃蛋白酶颇有发展前途.本文利用基因工程开展胃蛋白酶的表达研究，为解决这些问题提供了新的研究方向。第一，根据Genebank上公布的猪胃蛋白酶原A基因序列，进行引物设计，通过RT-PCR克隆获得了湖北白猪胃蛋白酶原A基因。第二，在猪胃蛋白酶原A克隆和序列分析的基础上，构建了毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K-pA。研究不同pH、不同诱导时间、不同启始浓度和甲醇诱导浓度等因素对表达量的影响。第三，根据毕赤酵母密码子的偏嗜性，利用定点突变，对稀有密码子进行了优化,希望能够进一步提高重组酵母表达量。关键词:胃蛋白酶原A；毕赤酵母；克隆；表达；优化AbstractAsparticacidproteases,knownasacidicproteases,cancatalyzethehydrolysisofproteinundertheacidcondition.Pepsiniswildlypresentedingastricjuiceofvertebrate.Currently，commerciallyusedpepsinisgenerallyobtainedfromanimalstomachtissue，whichisveryexpensiveandun-purebecauseoftheanimalorgansresourceconstraintsandotherproteases.Therefore，agreatinteresthasbeenfocusedonthenewmethodofproducingpepA(PepsinogenA).Amongthese，themicrobialproductionissupposedtobethemostpromisingmethodbecauseofitshighyield,simpleproductionprocessandlowercost.Therefore，theobjectiveofthisstudyistryingtoproduceefficientlyrecombinantporcinepepsinwithgeneticengineeringtechnologyinmicrobialsystem.Asparticacidproteasesarewidelyappliedinthefieldsoffeedadditive,vintage,food,leatherandmedicine.PorcinepepsinA,whichistheimportantmodelforthestudyofstructure-functionrelationshipofprotein,belongstothefamilyofasparticprotease.Usinggeneengineeringtostudytheexpressionofpepsinwillsupplyanewwayforsolvingthesequestionsinthispaper.Firstly,theprimersweredesignedaccordingtothesequenceJ04601inGenebank.AndthentheswinepepsinogenAcDNA,whichwasclonedbyRT-PCRfromtheHubeiWhiteswine.Secondly,therecombinantplasmidofpPIC3.5K-pAwasconstructed.EffectsofdifferentpH,differentinductivetime,differentinductiveconcentrationandmethanolinductiveconcentrationontheexpressionyieldwerestudied.Thirdly,basedonthecodonbiasofPichiapastorisandusedSMDtechnology,optimizationoftherarecodons,whichcouldinfluencetheyieldofrecombinant,wasdirectedsuccessfully.Thefurtherresearchisexpectedtoraisetheyieldofrecombinantyeast.KEYWORDS:PepsinogenA,Pichiapastoris,Cloning,Expression,Optimization第一章酸性蛋白酶的研究进展蛋白酶是一类可以水解蛋白质的酶，在生产、生活及科学研究领域的应用中占有重要地位。根据活性部位上功能基团种类的不同，蛋白水解酶可分为四大类:丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶[1]。天冬氨酸蛋白酶是以两个天冬氨酸残基为活性中心的肽链内切酶，其代表性特征是能够在酸性环境条件下水解动植物蛋白质，将两个疏水氨基酸打断，通过内切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸[2]。故通常将天冬氨酸蛋白酶称为酸性蛋白酶。1.1酸性蛋白酶的种类酸性蛋白酶被分为三个蛋白家族[3]，分别是A1起消化作用，包括胃蛋白酶和凝乳酶；A2起溶酶体的蛋白降解作用，包括组织蛋白酶D和E；A3起荷尔蒙调节作用，主要是高血压蛋白原酶。其中A1和A2蛋白家族具有较高的相似性，A3、A1和A2家族的相似性则相对较低。微生物酸性蛋白酶则被分为两种[1]:(i)由曲霉、青霉、根霉、链孢霉等产生的类胃蛋白酶；(ii)由毛霉和内座壳属产生的类凝乳酶。1.2酸性蛋白酶的来源蛋白酶是有机体生存所必需的，在自然界中普遍存在，来源也呈多样性。传统工艺中胃蛋白酶和凝乳酶主要是从猪、牛、羊等动物的胃粘膜中获得；素食食品加工业中应用的酸性蛋白酶主要是从木瓜、菠萝、无花果属植物中提取；现有的饲料用酸性蛋白酶主要来源于微生物产生。能够产生酸性蛋白酶的微生物有:黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉、根霉、微小毛霉、泡盛曲霉以及它们的变异株、突变株。此外，在逆转录病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等也有分泌酸性蛋白酶的报道[4-6]。1.3酸性蛋白酶的性质酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物，不同来源的酸性蛋白酶，虽具有一些共同性质，但在底物特异性、抑制剂、激活剂等方面均存在着一定的差异。1.3.1最适作用pH和pH稳定性酸性蛋白酶在pH值1.0～5.0之间均比较稳定，一般随着pH的升高酸性蛋白酶的活力会逐渐的降低，当pH大于6时，酶活力基本丧失。不同来源的酸性蛋白酶的最适作用pH稍有不同。1.3.2最适作用温度和温度稳定性酸性蛋白酶一般在50℃以下较为稳定，但是随酶的来源不同而有所差异。如猪的胃蛋白酶最适温度为40℃，在50℃水浴中保持20min，其剩余酶活力为30％，65℃水浴中保持10min其酶活力基本丧失[7]。1.3.3抑制剂一般情况，酸性蛋白酶的抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。霉菌酸性蛋白酶通常不受胃蛋白酶抑制剂对-苯的抑制，但却对N-溴代琉珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。此外，并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂抑制，如黑曲霉产的蛋白酶A1，A2和Scytalidiumligrcolum产的蛋白酶B对其均不敏感。1.3.4金属离子对酸性蛋白酶的影响有多数实验证明[8,9]，Cu2+、Mn2+等离子在低浓度（小于5mmol/L）下，对酸性蛋白酶具有显著的激活作用；Ag+对酸性蛋白酶具有显著但相对较弱的抑制作用；金属离子浓度对蛋白活性的影响较大，一般浓度大于10mmol/L时，Cu2+、Mn2+也会表现出不同的抑制作用；另外，酸性蛋白酶的作用底物不同，金属离子对活性的影响也有差异，但抑制或激活的趋势却不变。1.4酸性蛋白酶基因工程研究进展一般在工业中应用的酸性蛋白酶对其本身的性质都有特殊的要求。而蛋白质工程使重新设计基因，合成具有特殊功能重组酶成为可能。重组DNA技术和定点突变（SDM）技术又推动了蛋白质工程的快速发展。利用基因工程技术改善酸性蛋白酶性质以实现其在工业上的应用，是酸性蛋白酶的新的研究方向[1]。1.4.1国内外酸性蛋白酶基因工程研究目前，国内在医药与食品领域中应用的酸性蛋白酶，主要是胃蛋白酶和凝乳酶，是从猪、牛、羊等动物粘膜中提取，产量较低，价格昂贵，难以满足市场需要。在饲料添加剂领域中应用的酸性蛋白酶主要来源于微生物生产，国内微生物酸性蛋白酶的研究主要通过辐射、紫外线和亚硝基胍等物理和化学方法诱变选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，获得了一些很有应用前途的产酶菌株[7,8]。酸性蛋白酶的基因工程方面的研究近年才开展，邱重晏等[9,10]成功克隆出微小毛酶凝乳酶结构基因并在毕赤酵母中得到表达，还进行了粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因的克隆。而胃蛋白酶的基因工程研究还未开展。在国外，酸性蛋白酶基因工程方面的研究开展较早，相关的报道较多，重组凝乳酶产品已经获得上市，并取得了显著的经济效益。胃蛋白酶在天冬氨酸家族中胃蛋白酶的特异性和动力学，催化和抑制机制以及胃蛋白酶原的激活机制的研究最为深入，而且猪胃蛋白酶原和胃蛋白酶是蛋白质相关结构和功能关系的重要模型。胃蛋白酶是由一条单链组成的单体酶，属天冬氨酸蛋白酶家族，是一种内切酶，有326(7)个氨基酸残基，含有2个构象相似的结构域，2个活性位点Asp32:、Asp215:(一个是以一COOH形式存在，另一个是以一COO-一的形式存在)，6个半肤氨基酸残基，3对二硫键，5个色氨酸残基，16个酪氨酸残基，14个苯丙氨酸残基。分子量约为34.SKD。胃蛋白酶在pH范围1-3时活性较高，最适pH在2左右，当pH大于6时，胃蛋白酶便失去了活性，而且是不可逆失活[11]。胃蛋白酶的前体被称为胃蛋白酶原。猪胃蛋白酶原是多肽链，包括15个氨基酸信号肽，44个氨基酸活性肽，327个氨基酸胃蛋白酶成熟肽，从mRNA得到的cDNA约有1.2kb。A、B、C、D四种类型胃蛋白酶原中氨基酸组成有较大变化，Pro-5，Leu-6，Arg-8在A-C型中相同，Asp-32，Asp-215是活性中心的两个天冬氨酸残基，它们的初级和高级结构与其他天冬氨酸家族成员有很高的同源性[12]。1.5酸性蛋白酶的应用酸性蛋白酶发现于二十世纪初，包括有胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶等而微生物因为其广泛的生化多样性和基因容易改造而成为理想的蛋白酶资源。酸性蛋白酶现已广泛应用于饲料、食品、酿造、毛皮与皮革、医药、胶原纤维等各个行业之中。近年来，酸性蛋白酶在作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂上的应用得到人们广泛的重视[5,13,14,15]。1.6本研究的目的和意义饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量的提高已很困难。我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡、奶牛等饲料转化率均比国际先进水平低0.3～0.6个百分点，使得饲料资源不足的问题更加严峻。解决饲料资源不足的问题，可以从开源和节流两方面着手。开源即开发各种饲料资源，尤其是非常规饲料资源，节流即提高现有饲料资源利用率。饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足。添加外源性的消化酶可以补充内源消化酶的不足，提高饲料的利用率；消除饲料中的抗营养因子，降低动物消化道食糜的黏度，改善消化机能；改善肠道菌群分布，提高动物健康状况；参与动物内分泌调节，提高畜禽体内激素代谢水平；减轻畜牧生产对环境的污染；促进细胞包围的淀粉、蛋白质、脂肪的释放，通过水解细胞壁，使营养物质被充分吸收。因此，饲料用酶制剂在养殖业有着广阔的应用前景。1.6.1本研究的目的胃蛋白酶在饲料、皮革、酿酒、医学等领域具有很高的经济价值。但到目前为止，市场上的胃蛋白酶主要来源于动物的胃组织，如牛、羊、猪等的胃组织。动物源胃蛋白酶存在很多的问题，受动物脏器资源的限制，胃蛋白酶产量小，价格高，且酶活性低、质量不稳定，易产生有害化学物质残留。通过基因工程方法，如筛选高产菌株或者胃蛋白酶DNA重组后构建高产工程菌株，是解决胃蛋白酶目前应用“瓶颈”的一个有效方法。很多学者在这方面做了很多的研究，探索工业发酵生产胃蛋白酶，但目前国内外尚未见到通过基因工程发酵大规模生产胃蛋白酶的报道。本研究拟通过RT-PCR法，从猪胃腺细胞获得含猪胃蛋白酶原A编码区的DNA片段，并在毕赤酵母系统中表达，选用胃蛋白酶的前提物胃蛋白酶酶原A基因进行表达，这样可以避免胃蛋白酶对表达宿主的毒害作用，可提高宿主的表达产量。1.6.2本研究的意义胃蛋白酶是动物消化道种含有的一种主要的水解酶类，由胃底腺细胞分泌，用于消化饲料中的蛋白质。同时，胃蛋白酶作为饲料用添加剂，能够显著的提高饲料的利用率，促进动物生长，降低幼龄动物对饲料蛋白质消化能力较差而引起的腹泻的发生率，应用于动物生产中具有良好的经济效益和社会效益。现有的很多商品化的蛋白酶产品，多数是通过微生物发酵制得，来源于动物的胃蛋白酶主要是从动物体中提取。饲料添加剂中使用的蛋白酶其耐热性能较差，而且生产菌株产酶水平较低，所占由得比重很小，还有非常多的研究工作需要开展。本研究，以可作为饲用酵母且安全性好的毕赤酵母作为宿主菌，利用基因工程技术开展胃蛋白酶在毕赤酵母中表达研究，以期为生产蛋白酶奠定分子生物学基础。第二章猪胃蛋白酶原基因在毕赤酵母胞内表达及其培养条件的优化1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)作为宿主表达外源蛋白以来，作为一种新的高效表达系统，引起人们越来越大的重视。已成为分子生物学领域用于表达重组单摆的标准工具之一。到现在已有400多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中获得成功表达。2.1材料和方法2.1.1菌株、质粒、基因毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K、毕赤酵母GS115菌株都是购自Invitrogen公司；克隆质粒pGEM-T购自TaXara公司；PepsinogenA基因由湖北省农业科学院畜牧所克隆、保存。2.1.2工具酶及其他试剂限制性内切酶VamHI、EcoRI、NotI、SacI、以及T4DNA连接酶、LATaqTM聚合酶和限制性内切酶均购自TaKaRa宝生物工程公司；T4DNA连接酶及连接试剂盒购自Progmega公司；DNA胶回收试剂盒购CLONTECH公司；DL2000标准分子量购于广东东盛生物有限公司；HindIII标准分子量购于宝生物生物工程公司；N，N，-甲叉双丙烯酰胺、SDS、胃蛋白酶、购于Sigma；过硫酸铵、TEMED购自AMRESCO；干酪素、Folin试剂、硫酸铵、试剂购于中西仪器大全；DAB显色试剂盒、Bradford试剂盒购于上海申能博彩生物科技有限公司；其余试剂为国产、进口分析纯。2.1.3试验仪器凝胶电泳装置、电转移槽、电转化仪（Bio-rad）；分光光度计（光径1.0cm比色杯）；凝胶成像分析系统；超声波仪；震荡器；酶标仪；生化培养箱、电子分析天平、超净工作台、台式高速离心机（CR21G）、-70℃医用冰箱、低温离心机（HITACHICR21G）、Bid-rad电泳仪、台式高速离心机、水平电泳仪、PCR扩增仪、自动高压灭菌（SA-300VA）、恒温水浴锅、紫外透射议。2.1.4培养基及溶液配制培养基LB培养基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶于800mL去离子水中，用2MNaOH将pH值调至7.0～7.2，定容至1000mL，高压灭菌(1.034×105Pa)20min；（固体培养基含1.5％的琼脂粉；氨苄青霉素抗性培养基，Amp终浓度为100mg/mL。）MD培养基:YNB13.4g/L，葡萄糖20g/L，生物素4×10-4g/L，琼脂粉20g/L；MM培养基:YNB13.4g/L，甲醇5mL/L，生物素4×10-4g/L，琼脂粉20g/L；YPD培养基:酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基1.5％～1.8％琼脂粉)。BMGY培养基:酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10mL/L，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)；BMMY培养基:酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇5mL/L，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)；上述培养基中，YNB、甲醇、生物素、氨基酸需过滤除菌，含葡萄糖培养基需在108℃灭菌30min，其余均在121℃灭菌20min。WB（WesternBlotting）用试剂(1)2×样本缓冲液Tris-HCl125.0mmol/L，SDS4.0％(W/V)，BromophenolBlue0.005％(W/V)，Sucrose350.0mmol/L，DTT150.0μL，pH=6.8。(2)30％丙烯酰胺贮备液:丙烯酰胺30g，双叉丙烯酰胺0.8g，溶于超纯水，终体积为100mL以定性滤纸过滤存放于4℃。(3)3.8倍分离胶缓冲贮备液:Tris-HCl(pH=8.8)3.0mol/L，SDS1.0％(W/V)，存放于4℃备用。(4)4倍浓缩胶缓冲液贮备液:Tris-HCl0.5mol/L，SDS0.4％(W/V)，pH=6.8存放于4℃备用。(5)浓缩胶贮备液:丙烯酰胺贮备液16.7％（V/V），4倍浓缩胶缓冲液贮备液25％（V/V）。(6)10％过硫酸胺（W/V）:取1g过硫酸胺加入10mL超纯水，使用前新鲜配制。(7)Tris-甘氨酸电泳缓冲液:Tris-Base25mmol/L，Glycine250mmol/L，SDS0.1％，pH=8.3。(8)转移槽电极液:Tris-Base25mmol/L，Glycine192mmol/L，甲醇20％，pH8.3。(9)丽春红染色液:丽春红S2g、三氯乙酸30g、璜基水杨酸30g加水至100mL。用一份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液。(10)TBST（Tris盐含Tween-20缓冲液）:Tris-Base20mmol/L,NaCl137mmol/L，Tween-200.3％(V/V)，pH=7.6。(11)抗体封闭液:用TBST缓冲液配制5％脱脂奶粉。胃蛋白酶活力测定试剂(1)0.55M碳酸钠溶液(2)10％三氯乙酸(3)0.05mol/LpH=2.0乳酸-乳酸钠缓冲液A液:称取10.6g80%~90％乳酸加蒸馏水定容至1000mL。B液:称取16g70％乳酸钠加蒸馏水定容至1000mL。取A液16mL与B液1mL稀释1倍即成0.05mol/LpH2乳酸-乳酸钠缓冲液(4)0.5％干酪素:0.5g，以0.5NNaOH1mL湿润。再加少量0.02MpH＝7.5磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至100mL，冰箱中可保存一周。其他试剂酵母细胞裂解液:5mMEDTA0.18612g，150mMNaCl0.8766g，50mMTris-HCl，1％TritonX-1001mL。蒸馏水94mL，4℃保存，使用前加入1mMPMSF。100％饱和硫酸铵:在100mL水中加入过量硫酸铵，加热至50℃～60℃，保温0.5h，趁热过滤除菌去沉淀，用氨水调节pH至7.5，4℃保存。2.1.5引物设计根据Genbank发表的EF108301猪胃蛋白酶原A序列，以带有猪胃蛋白基因（pA）的pGEM-T为模板设计PCR扩增引物，正向引物:5′-CTTGAATTCTGGGAGCCAGGAA-3′，其中斜体部分为EcoRⅠ酶切位点，反向引物:5′-TATGCGGCCGCGATAGAACCAAGGCG-3′，其中斜体部分为NotⅠ酶切位点。PCR反应条件按常规设置进行:94℃预变性3min；94℃变性45s，57℃复性45s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min。2.1.6PCR产物的酶切及回收PCR反应条件按常规设置进行：94℃预变性3min；94℃变性45s，57℃复性45s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min。取5μLPCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析结果。然后用EcoRⅠ、NotⅠ双酶切该PCR产物，双酶切体系为：10×Multibuffer1μL，100×BSA0.1μL，EcoRⅠ(10U)0.5μL，NotⅠ(10U)0.5μL，PCR产物5μL，ddH2O2.4μL，总体积10μL。37℃酶切3h。2.1.7酵母表达载体的构建与鉴定图2-1.重组表达载体构建示意图Fig2-1.ConstructionofrecombinantexpressionvectorpPIC3.5k-pA重组表达质粒的构建如图2-1，利用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ从PCR产物上双酶切含猪胃蛋白酶原A基因的DNA片段，克隆到载体pPIC3.5K上，得到pPIC3.5K-pA。用DNA回收试剂盒，回收该产物，对重组子用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定。0.8％琼脂糖凝胶电泳分析结果，鉴定插入其片段的大小。2.1.8重组表达载体的线性化将上述鉴定的阳性克隆，挑菌过夜培养，大提质粒，将其线性化，用于电转化。挑阳性克隆子至100mLLA液体培养基，37℃250r/min培养过夜。质粒的大量制备(1)SorvallGS转头在4℃下，4000r/min离心15min；(2)去掉上清，将细菌沉淀物重悬于2mL冰预冷的溶液Ⅰ中，震荡器震荡，使菌体完全悬浮；(3)加4mL新配制的溶液Ⅱ，缓慢颠倒离心管5~10次，确保离心管中的整个内表面与溶液Ⅱ充分接触。将离心管放在冰水混和物上5min；(4)加3mL预冷的溶液Ⅲ，将离心管倒置后温和震荡10次，冰浴10min；(5)SorvallGS转头在4℃下，4000r/min离心15min。将上清移到另一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇充分混匀，－20℃放置30min；(6)SorvallGS转头在4℃下4000r/min离心15min。去掉上清，烘箱中烘干残余的乙醇；(7)用8mL10mmol/LTris-CL(PH8.0)悬浮沉淀，加等体积的2.9mmol/L亚精氨酸盐充分混匀后室温放置15min。SorvallGS转头在4℃下，4000r/min离心15min,去上清；(8)用50％异丙醇16mL悬浮沉淀，充分混匀后4℃放置45min~60min，SorvallGS转头在4℃下4000r/min离心15min，去上清；(9)75％乙醇6mL悬浮沉淀后4000r/min离心15min，彻底去掉上清。用500μLTE或纯水溶解DNA沉淀。质粒的线性化酶切反应体系如下：重组表达载体质粒DNA50μg，10×BufferA10μL，Sac（30U）3μL，灭菌去离子水补水至100μL，总体积为100μL。37℃酶切过夜。2.1.9重组载体转化毕赤酵母酵母感受态的制备(1)在YPD平板上划线培养毕赤酵母菌，30℃孵育2d；(2)从平板上挑取单克隆于10mLYPD中，30度振荡过夜；(3)在100mLYPD培养基中接种等量的过夜培养物，至OD600值达0.1，在30℃生长至OD600为0.5～0.8；(4)室温3000r/min离心收集细胞，用50mLBufferA洗涤细胞1次；(5)用4mLBufferA重悬细胞，分成0.2mL等份分装至1.5mL离心管中，加入11μLDMSO于各管中，混合，并在液氮中快速冷冻细胞；(6)存于-70℃。电转化条件200μLGS115酵母感受态细胞中加入线性化质粒DNA5μg～10μg――注入冰预冷电转杯5min(2mm转化杯)――电转化（1500V，200，25μF电容电穿孔转化）――加入1mL1Msorbitol于电转杯――转入1.5mL离心管――30℃静养1h――离心去上清一半，补加YPD液培养1h——取200μL涂YPD板――30℃培养至重组子出现（2d～3d）。2.1.10高表达菌株的筛选甲醇利用表型的确定用灭菌牙签挑取转化子对应点种到MM和MD筛选培养基平板上，30℃培养2d，观察转化子在MM和MD平板上的生长情况。醋酸洋红-纤维蛋白的制备(1)抽取新鲜猪血250mL，用灭菌牙签不停搅动，提取的纤维蛋白用ddH2O冲洗干净；(2)加入配好的醋酸洋红溶液，浸泡过夜后，用ddH2O冲洗干净，4℃保存备用。筛选方法培养电转化重组酵母，OD600值达到2～6（酵母生长对数期），5000r/min离心，弃上清，加入5mLBMMY，使初始浓度OD600＝１，每24h加入适量的100％甲醇诱导，使甲醇终浓度维持在0.5％，48h收集1mL菌体（剩余取3mL冻存），加入120μL细胞裂解液，加入等体积的酸化玻璃珠，在震荡器上震荡30s，迅速置于冰浴30s，反复8次。离心取上清，1mol/LHCI调PH至2，分别加入等体积醋酸洋红染色的纤维蛋白，37℃过夜消化，以上的筛选过程重复3次。初次筛选出17株强阳性菌，将剩余的菌体裂解后取上清，60％饱和硫酸铵4℃过夜沉淀，离心弃上清，加入0.01mol/L、PH=2的乳酸缓冲液250μL，室温酸化0.5h，吸取50μL于0.5％干酪素琼脂平板上，40℃过夜。2.1.11破碎方法酸化玻璃珠震荡破碎方法同酸化玻璃珠-超声破碎收集菌液，洗涤，用细胞裂解液稀释至OD值为50～100，加入适量酸化玻璃珠进行超声破碎，功率100W，破碎20s，冰浴20s，重复7次。2.1.12重组酵母基因组PCR分析将经筛选的阳性克隆子挑菌落放入含有200μL细胞裂解液的1.5mL的离心管中，再加入一滴酸化玻璃珠，经超声破碎，离心取上清，用引物P1和P2进行PCR鉴定。2.1.13重组蛋白的表达9号菌种进行活化培养，将生长对数期的酵母接种到25mLBMMY中，起始浓度OD600为2，培养基pH=7，甲醇诱导浓度为1%，在100mL的摇瓶中进行诱导，每隔24h取菌体3mL，连续取5d。收集菌液，洗涤，加入3mL细胞裂解液和适量酸化玻璃珠进行超声破碎，功率100W，破碎20s，冰浴20s，重复7次。离心取2mL上清，60％饱和硫酸铵沉淀，4℃过夜，8000r/min离心弃上清，加入300μL细胞裂解液，取20μL上样，进行SDS与WB。2.1.14蛋白质印迹杂交WB一抗的制备1.免疫称取0.004g胃蛋白酶（1:3000），加入250μL生理盐水，再加入250μL弗氏佐剂，注射器充分雾化，每只小鼠注射50μL（约0.4mg/只），背部、颌下、脚掌、皮下等，多点注射，每隔7d免疫一次，免疫3次，最后隔5d进行一次加强免疫。2.血清制备（小鼠眼球取血）(1)剪去免疫小鼠的眼毛和胡子，酒精消毒；(2)一只手固定小鼠，同时压迫眼球，使眼球突出，另一只手用消毒的镊子摘除小鼠眼球，将血液滴入1.5mL灭菌离心管中；(3)于4℃冰箱中静止2h，5000r/min离心，0.2mL分装冻存。3.琼扩试验(1)用生理盐水配制1.0％～1.5％琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5mL趁热浇于载玻片上，制成琼脂板；(2)待琼脂凝固后，用打孔器打成梅花形孔图，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）；(3)在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏；(4)将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24h～48h后观察结果。操作步骤(1)变性蛋白质样本的制备取100μL的蛋白样本加入等量的2×蛋白样本缓冲液混合均匀，放在沸水中煮沸10min，立即放入冰水浴中，冷却再放入-20℃冰箱中。冷藏使用前，再用蛋白样本缓冲液按照蛋白定量结果把所有样本蛋白调节成相等浓度。(2)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）制备配制12％分离胶溶液，倒入装置好的玻璃槽中约4/5高，上层轻轻地覆以适量蒸馏水隔离胶体与空气，并使表面平整。30min后，待胶体凝结，倒掉水并以超纯水冲洗干净，以定性滤纸吸干表面残余蒸馏水，取配制好的5％浓缩胶贮备液4mL，加入10％过硫酸胺40μL和TEMED4μL，迅速搅拌均匀后倒入玻璃槽内，插入样品梳，待胶体凝结后取出样品梳。(3)电泳在电泳槽内加入电泳槽电极液，赶出样品槽内的气泡，在样品槽内分别加入蛋白电泳分子量标准品和蛋白样，上样量为20μg，接通电源，先以80V的恒压电泳40min，再以120V的恒压电泳，约2.5h，直到溴酚蓝染料抵达分离胶底部切断电源。(4)转膜取下的SDS胶，甲醇预浸透硝酸纤维素膜（PVDF）、定性滤纸以及纤维垫，放在电泳槽转移液内，以夹三明治方式，即中间为胶体和硝酸纤维素膜外面，分别夹以滤纸和纤维垫，夹牢并彻底清除内部的气泡，然后放入装满转移缓冲液的转移槽，正确接通电极，以20V恒压、4℃下转膜过夜，将胶体上的蛋白质转印到PVDF膜上。(5)立春红染色将转印蛋白的PVDF膜浸入立春红使用液中，显色5min，自来水冲洗至有蛋白条带清晰可见，铅笔标记阳性蛋白位置。(6)封闭将转有蛋白的PVDF膜取出，标记方向和蛋白分子量标准印记，然后浸入5％脱脂奶粉的抗体封闭液中，摇床上室温下孵育2h，以封闭非特异性蛋白结合位点。以TBST缓冲液于摇床上洗膜4次，每次15min。(7)抗体标记将PVDF膜浸于封闭液稀释的一抗（1:8）孵育液，室温2h，以TBST洗膜，方法同前，之后将PVDF膜，浸入含有辣根过氧化酶标记的二级抗体（1:2000）的孵育液中，在室温下摇晃孵育1.5h，再以TBST洗膜3次，每次10min。(8)显色成像利用辣根过氧化酶DAB显色试剂盒进行化学显色，扫描保存。2.1.15酵母细胞光密度OD600的测定收集菌体用去离子水洗涤后将光密度稀释至0.2～0.8之间，以去离子水做对照，于波长600nm处进行比色测定，OD600=OD读数×稀释倍数，试验重复三次。2.1.16Bradford总蛋白含量测定(1)将白蛋白标准品（500μg/mL）摇匀，吸取0，2，4，6，8，10μL分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足至10μL，混合均匀；(2)各孔加入250μLG250染色液，充分混匀，室温放置10min；(3)用酶标仪测定A595波长的吸光度，记录数据；(4)重复三次，取平均值绘制标准曲线；(5)将待测样品浓度稀释至吸光度在标准品的吸光度的范围内，重复三次，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。2.1.17重组胃蛋白酶酶活力的测定方法酶粗提液的制备取冻存的细胞裂解液，用0.1mol/L，pH为2的乳酸-乳酸钠缓冲液，稀释到1mL，在室温的条件下酸化0.5h，备用。酶活力测定(1)标准曲线的制作:精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至100mL，分别配制溶液0-100μg/mL不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1mL，加0.5％酪素1mL，于40℃水浴中反应10min，然后加入三氯乙酸2mL，离心除去沉淀。取清液1mL，加入0.55M碳酸钠5mL，再加入福林试剂1mL，于40℃水浴显色15min，在680nm波长下比色，测光密度（OD）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。(2)样品测定40℃水浴显色15min，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。(3)计算以干酪素(酪蛋白)为底物，40℃，PH=2的条件下，每分钟分解底物生成1μg酪氨酸的酶量为一个酶活单位。蛋白酶的活力单位(U/mL)＝A/10×4×FA为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg数F为酶液最终稀释倍数，4为试管中反应液总体积(毫升)，10为反应时间（min）。2.1.18培养条件优化诱导时间的优化挑取干酪素琼脂平板法筛选出来的表达量最高的９号菌株，作为种子进行培养条件的优化。将生长对数期的酵母接种到25mLBMMY中，PH=6，在100mL的摇瓶中进行诱导，其他的培养条件同，每隔24h取菌体3mL，连续取5d。收集菌液，洗涤，加入3mL细胞裂解液和适量酸化玻璃珠进行超声破碎，功率100W，破碎20s，冰浴20s，重复7次。离心取2mL上清，60％饱和硫酸铵沉淀，4℃过夜，8000r/min离心弃上清，加入0.01mol/L、PH=2的乳酸缓冲液1mL，室温酸化0.5h后按照进行酶活测定，以相对酶活力为纵坐标，诱导时间为横坐标，绘制图表。最适pH优化分别配制pH值5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸盐缓冲液BMMY培养基，取6个相同容量的三角瓶(100mL)，分别加入25mL不同pH的BMMY，其他的培养条件同，诱导72h收集菌体，酵母处理同上。以相对酶活力为纵坐标，不同的pH值为横坐标，绘制图表。启始浓度和甲醇诱导浓度的优化以启始浓度为A因素（处理水平为OD1、OD2、OD5、OD10）和甲醇诱导浓度为B因素（处理水平为0.5％、1％、2％的终浓度）进行二因素三水平二重复全实施试验，培养5d。每隔24h取样测定OD600和72h收集菌体测定酶活，方法同上。2.2结果与分析2.2.1酵母表达载体的构建与鉴定pPIC3.5K-pA载体为模板，以特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，电泳结果如图2-2，并经测序，证明了载体构建的正确性。图2-2pPIC3.5K-pA的鉴定(图形大小为245X247象素，6.46X6.51cm)M:λ/HindIIImarker；1:pPIC3.5K-pA/EcoRI；2:pPIC3.5K-pA/EcoRI+NotI；3:PCRproductofpPIC3.5K-pA；N:DL2000marker.2.2.2酵母的电转化和筛选在MD平板上正常生长而在MM平板上生长很慢或不长的菌株，可以判断重组菌株为HIS+MUT+表型，共121株。根据纤维蛋白被消化后的颜色深浅初步筛选出颜色很深，且重复稳定的重组子17株，再根据干酪素-琼脂平板水解法筛选，干酪素为酸性蛋白酶的特异性底物，且不被弱酸水解，如图2-3a。用特异性引物P1和P2进PCR鉴定，如图2-3b。图2-3a干酪素琼脂平板筛选高表达菌株NO.9:TherecombinantyeastwithplasmidpPIC3.5k-pA；GS115TherecombinantyeastwithplasmidpPIC3.5k.图2-3b重组酵母PCR检测(322X125，8.18X3.18cm)M:DL2000marker；1:ProductofpPIC3.5K-pA；2:GS115；3:No.2；4:No.9；5:No84；6:No.Bradford标准曲线及蛋白浓度测定以BSA为标准品测定的吸光度-蛋白浓度的标准曲y=0.0005x+0.0399R2=0.9012，将2.1.14浓缩的蛋白稀释2倍，取10μL，按照表2-1，测得平均吸光度为0.240，则总蛋白浓度为800μg/mL，根据QuantityOne软件分析已知，胃蛋白酶原约占7%，计算可得蛋白表达量约为56mg/L。表2-1不同标准白蛋白浓度的吸光度Table2-1TheabsorbanceofdifferentstandardBSAdensity.按上表中的数值，绘制吸光度-蛋白质浓度标准曲线，如下图所示：图2-4吸光度-白蛋白浓度标准曲线2.2.4酶活力标准曲线重组胃蛋白酶活力采用Folin酚法测定，标准曲线的测定数据如表2-2，标准曲线如图2-5，经拟合得Y=0.0035x+0.005R2=0.9992，求酪氨酸的含量，计算酶活力。表2－1不同浓度酪氨酸的光密度图2－5吸光度－酪氨酸标准曲线图2.2.5重组酵母培养表达条件的优化表达时间的优化酶活测定表明，24h表达酶活仅为72h的1/3，随着重组酵母培养至72h时，酶活力最高，继续培养时，表达酶活逐渐下降，如图2-6。图2-6不同的诱导时间对胃蛋白酶表达的影响最适pH酶活测定显示，pH5.0～7.5范围内，pH＝7时酶活力最高，同时OD600测定还表明，pH＝7时，酵母生长密度最高，如图2-7。图2-7不同pH培养基对胃蛋白酶表达的影响启始浓度和甲醇诱导浓度的优化重组酵母启始密度和甲醇的诱导浓度与胃蛋白酶表达密切相关，从图2-8可以看出当启始OD=1时，酵母的菌体浓度在整个培养周期明显的低于其他启始浓度OD=2、5、10。而启始浓度OD=2、5、10之间在培养过程的菌体浓度差别不大。甲醇终浓度为1％和2％时，酵母的生长趋势与0.5％时基本一致，图表未列出；表2-3中，72h的酶活测定显示，OD=2，甲醇终浓度为1％时，酶活力最高。图2-8在甲醇终浓度为0.5%时不同启始浓度表2-3不同启始浓度和甲醇诱导浓度条件下的酶活力的对酵母生长的影响2.2.6重组酵母胞内表达胃蛋白酶原SDS根据上面的优化条件，培养基BMMY的pH为7，重组酵母的启始浓度OD为2，甲醇诱导的终浓度为1％，分别收集甲醇诱导前和诱导培养5d的酵母菌液，破碎离心，取上清浓缩后，上样电泳。由SDS的电泳图2-9可知，与阴性对照相比，经甲醇诱导的重组酵母明显的多出两条蛋白条带:一条在97KD-66KD之间，为重组菌的醇氧化酶蛋白，经BIO-RAD凝胶成像QuantityOne软件分析，醇氧化酶蛋白约占胞内总蛋白的38％；另一条在45KD左右的胃蛋白酶原A，分子量与已知的天然猪胃蛋白酶原的分子量相当，仅占总蛋白7％左右。图2-9胃蛋白酶原在毕赤酵母表达的SDS.2.7重组胃蛋白酶WB将60％饱和硫酸铵沉淀的重组胃蛋白酶原的上清液调节pH为2，室温酸化0.5h后，进行蛋白电泳，再以自制抗体做WB检测，结果如图2-10，可见重组蛋白有良好的生物活性。图2-10WB鉴定重组胃蛋白酶1.NegativeControl；2.RecombinantpAofinducedat72h；3.RecombinantpAofinducedat96h2.3讨论毕赤酵母是一个近年发展起来的新型低等真核表达系统，具有经济、容易操作、表达率高、外源基因遗传稳定、蛋白翻译后加工正确（如:蛋白的正确折叠、二硫键的形成）等优点，已经广泛的应用于外源蛋白的表达[67]。同时，毕赤酵母也是良好的饲料添加剂，可在简单的培养基上高密度发酵，结合毕赤酵母胞内表达的优势，又可以免去基因工程下游提取、纯化工作，还可以充分利用酵母蛋白源，作为复合饲料添加剂具有广泛的应用前景[68－70]。2.3.1重组酵母筛选高表达菌株的筛选是毕赤酵母表达外源蛋白的重要环节之一。根据重组蛋白的性质确定特异而有效地筛选方法是高效表达外源基因的前提条件。本实验根据蛋白酶水解蛋白的特性，将猪血中提取的纤维蛋白经醋酸洋红染色后与重组酵母破碎上清混合，进行消化试验，通过感观观察颜色深浅，初步筛选出17株阳性菌株；再根据其特异性底物－干酪素琼脂平板确定高表达菌株两株，分别为9号和89号，试验已证明上述筛选方法直观准确。2.3.2重组酵母培养条件的优化影响外源基因表达的因素很多，本实验主要探索培养条件对表达的影响。表达时间和最适pH值的优化:经酶活测定可知，表达高峰出现在72h，最适pH为7.0。与已知胞内重组蛋白的表达时间和最适pH基本一致，原因可能是胞内表达环境比较稳定，受外界环境影响较小，摇瓶水平培养时，酵母在pH6～8时最适生长，72h～96h时达到最高。重组酵母启始密度和甲醇的诱导浓度与外源蛋白表达密切相关，从图2-8可以看出当启始OD为1时，酵母72h的菌体浓度明显的低于其他启始浓度OD为2、5、10时，菌体浓度成为限制表达的主要因素，本实验中在甲醇终浓度为1％时，启始浓度OD600为1时的酶活明显的低于启始浓度OD600为2时。而启始浓度OD为2、5、10之间在培养过程的菌体浓度差别不大，但启始浓度OD600为5、10时，酶活与启始浓度OD600为2时的酶活差别显著，其主要原因可能是菌体密度增加的同时也增加了耗氧量，溶氧量降低导致了外源蛋白表达的显著降低，溶氧也是P.pastoris发酵罐水平外源蛋白表达量高于摇瓶水平的主要因素。郭美锦[71]等在表达重组人血清白蛋白时，当启始OD600为5～30时，单位细胞光密度的蛋白表达产率几乎呈直线下降。李鹂等[72]在摇瓶表达阿片肽时，最适的启始浓度OD600为2.4时，高于此启始浓度时，阿片肽的表达量也随之减少。甲醇的需求量还与重组菌的表型有关。在外源基因表达时多选用MUT+表型，可以正常利用甲醇，较MUTS表型生长速度快，更适合大规模发酵生产。本实验也选用MUT+表型，优化后甲醇浓度为1％，高于Invitrogen手册推荐量0.5％。但甲醇浓度为2％时，72h的表达量和菌体浓度较1％的浓度都有所降低，可能是过量甲醇对酵母产生了毒性作用。而韩雪清等[73]在重组猪瘟病毒E2蛋白的最适甲醇诱导浓度在3％左右，这可能是两者的培养体系不同，菌体浓度不同，甲醇的需求量也有一定的差别。通过培养条件的优化，重组胃蛋白酶活由最初的3.86U/ml提高到6.46U/ml，SDS电泳显示，重组胃蛋白酶原约占总蛋白的7％左右，表达量约为56mg/L。经WB检测，在35KD处可以看到阳性条带，表明了重组蛋白具有良好的生物活性。2.4小结(1)成功构建了毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K-pA；(2)确立了重组胃蛋白酶菌株的筛选方法，通过纤维蛋白－醋酸洋红消化实验和干酪素琼脂平板法筛选出两株高表达克隆，分别为9号和89号；(3)经过表达条件的优化，确定在起始浓度为2，甲醇诱导浓度为1％，培养基pH为7，表达72h时，重组酵母表达量最高，为56mg/L；(4)经WB检验，重组胃蛋白酶有良好的生物活性。第三章猪胃蛋白酶原A基因稀有密码子的优化目的基因的特性会影响其在毕赤酵母中的表达，其中密码子的使用是影响异源表达的重要因素之一。已有许多试验表明，对基因进行密码子的优化改造可以提高其在毕赤酵母的表达量。猪胃蛋白酶原A基因中有17个使用频率极低的密码子，且多集中分布在基因的两端，推测将基因中部分稀有密码子按照毕赤酵母的优越密码子进行优化会提高其在酵母中的表达量。3.1材料与方法3.1.1菌株、质粒、基因DH5α感受态由本实验室制备，克隆质粒pGEM-T购自TaXara公司，pA基因由湖北省农业科学院畜牧所克隆、保存。3.1.2工具酶与生化试剂Klenowenzyme，其他工具酶与生化试剂同第二章主要仪器设备生化培养箱、电子分析天平、超净工作台、台式高速离心机（CR21G）、-70℃医用冰箱、低温离心机（HITACHICR21G）、Bid-rad电泳仪、台式高速离心机、水平电泳仪、PCR扩增仪、自动高压灭菌锅（SA-300VA）、恒温水浴锅、紫外透射议。3.1.4培养基及溶液配制培养基LB培养基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶于800mL去离子水中，用2MNaOH将pH值调至7.0～7.2，定容至1000mL，高压灭菌(1.034×105Pa)20min；（固体培养基含1.5％的琼脂粉；氨苄青霉素抗性培养基，Amp终浓度为100mg/mL。）主要溶液和缓冲液的配制EDTA(pH=8.0):在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸钠盐（EDTA-Na.2H2O），在水浴中加热并搅拌，用NaOH调节pH值至8.0，然后定容至1000mL，分装后高压灭菌，室温保存。10mg/mL溴化乙锭:在100mL蒸馏水中加入1g溴化乙锭，搅拌至完全溶解，放于棕色瓶中，室温保存。1MTris.Hcl:在800mL去离子水中溶解121.1gTris碱，用浓盐酸调节pH值至8.0.。50×TAE贮存液:242gTris碱、57.1mL冰乙酸、100mL0.5MEDTA(pH8.0)。X-gal:用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/mL的贮存液。放置于棕色塑料瓶中，贮存于-20℃。3.1.5引物设计3.1.6突变的步骤方法(1)以pAcDNA基因为模板，用引物Fw53和R1112扩增出1068bp的大片段，引物F1101和R1227扩增116bp的小片段；(2)取回收突变大片段的DNA和小片段DNA各5μL，于沸水浴变性10min后迅速置冰上冷却。(3)在冰上添加:2μLdNTPmix1μLKlenowenzyme(4)混匀并短瞬时离心，然后于37℃孵育2h。(5)加入2μL0.2MEDTA，pH8.0以中止反应。(6)加入2.5μL4MLiCl及75ul经-20℃预冷的无水乙醇，充分混匀，-70℃放置30min或-20℃放置2h。(7)12000r/min离心15min，用50μL预冷的70％乙醇洗涤沉淀物。(8)真空短暂干燥，用50μLTE溶液溶解沉淀。(9)然后取5μL作为PCR模板3.1.7PCR产物纯化回收(1)在紫外灯下将含有DNA片段的琼脂糖凝胶切下，转移到一个洁净的1.5mL离心管中；(2)加入3倍体积的溶胶液，（按每100μL体积胶加入300μL溶胶液，置50℃水浴10min，每隔2min颠倒混匀一次，使agarose胶完全溶化；(3)加入10μL的玻璃奶（玻璃奶使用前充分混匀），颠倒混匀，冰浴下放置10min。每隔2min~3min混匀一次，12000r/min离心30sec，吸弃上清；(4)加250μL漂洗液（浓缩漂洗液使用前，按浓缩漂洗液：无水乙醇=3：7配制成工作浓度），用加样器吹打漂洗液，将玻璃奶悬浮混匀，12000r/min离心30sec，吸弃上清；(5)重复步骤4（尽量吸尽漂洗液）。吸完后漂洗液后再离心10sec，用Tip头将最后一滴洗液吸干净，然后放在室温下干燥20min；(6)加适量洗脱液或无菌水或TE，混匀，室温孵育10min，12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，于4℃或保存于－20℃。3.1.8PCR产物连接和转化测序PCR扩增基因片段与pGEM-T载体的连接PCR扩增产物利用PCR产物快速回收试剂盒回收。胃蛋白酶原基因的回收产物与TA克隆pGEM-T载体连接，反应体系:扩增基因片段回收产物7.5μL，pGEM-T载体0.5μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1.0μL，T4DNA连接酶（3U）1.0μL，总体积为10.0μL，4℃连接过夜。感受态菌的制备(1)取一支无菌的三角烧瓶，在超净工作台中加入20mLLB（不含抗菌素）培养基；(2)从超低温冰柜中取出DH5α菌种种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入培养基中，37℃摇床培养过夜；(3)取0.5mL上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2h～3h，测定OD590为0.375。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行；(4)将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，12000r/min离心5min；(5)将离心管倒置以倒尽上清液，加入750μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即混匀，插入冰中放置30min；(6)4℃，12000r/min离心5min，弃上清液后，用100μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏。细菌转化(1)事先将恒温水浴的温度调到42℃；(2)取出一管（100μL）感受态菌，插入冰上，并于5min～10min；(3)加入5μL～10μL连接好的质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上20min；(4)轻轻摇匀后插入42℃水浴中90sec进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min～5min；(5)在超净工作台中向上述各管中分别加入800μLLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h；(6)如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，先在平板上滴加40μL2％X-gal，4μL20％IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀；(7)在超净工作台中取上述转化混合液100μL～300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀；(8)在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30min～60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜；(9)观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。3.1.9序列分析利用软件CodonW1.4.2(ftp://www.molbiol.ox.ac.uk/cu)计算密码子使用频率和密码子第三位上碱基含量；利用MFOLD软件（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html）在线分析RNA的二级结构；利用DNAssist分析软件进行DNA和蛋白质序列的比较分析。3.2结果与分析3.2.1胃蛋白酶原A基因改造设计对胃蛋白酶原A基因进行了部分密码子改造如下:LeuCTC（TTG），ProCCG（CCA），ArgAGG（AGA），ArgCGC（AGA），括号中为突变后的优越密码子。3.2.2基因合成通过两步PCR扩增和链延伸进行基因片段拼接，由电泳结果如图3-1，拼接获得的片段大小为1.2kb，与预测结果相同，将拼接片段PCR后与pGEM-T载体连接，转化E.coli，挑取3个重组克隆进行PCR验证后测序，测序结果表明有2个重组克隆获得了完全正确的改造。图.3-1胃蛋白酶原基因优化过程中的不同片段M:DL2000marker；1.F1101－R1227；2.F53－R1112；3.F53－R12273.3讨论许多因素会影响外源基因在宿主细胞中的表达，例如目的基因的特性、载体和宿主菌、整合方式、基因剂量、启动子的选择、外源蛋白德稳定性及培养条件等[75]，其中目的基因的特性是决定表达成功与否的首要因素，密码子的偏嗜性是结构基因的重要特性。3.3.1目的基因密码子的使用对异源表达的影响密码子具有简并行，同一个氨基酸可以有2～6种密码子编码，不同密码子多对应的tRNA的浓度有很大差异，在蛋白质合成肽链延伸过程中，当tRNA浓度高时可以很快的携带相应的氨基酸连接到肽链上，因此蛋白合成速度就快；对于稀有密码子，其所对应的tRNA浓度也低，影响肽链连接，降低了蛋白合成速度，从而降低外源蛋白的表达量[76]。研究还发现基因中含有过量的稀有密码子会造成相应的mRNA的降解，降低mRNA的稳定性[77]；在众多稀有密码子中，编码精氨酸的AGG和AGA的使用频率最低，当有两个相距很近时，严重影响翻译进程[78]。因此，外源基因密码子的选用对异源表达具有重要影响。采用宿主偏爱的密码子，减少或避免使用稀有密码子是提高异源表达量的有效措施之一。许多试