细胞生物学-细胞周期的调控

关于细胞生物学-细胞周期的调控第1页，共53页，2023年，2月20日，星期五第二节细胞周期的调控

MPF的发现及其作用细胞周期运转的调控第2页，共53页，2023年，2月20日，星期五一、MPF的发现及其作用1Rao和Johnson(1970、1972、1974)以Hela细胞为材料，发现M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即促细胞分裂因子(mitosis-promotingfactor，MPF)第3页，共53页，2023年，2月20日，星期五------使间期细胞出现类似于有丝分裂期的形态变化：染色质凝集，核被膜破裂及核仁消失，将这种现象叫做染色体超前凝集(prematurechromosomecondensation)。将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合。结果----第4页，共53页，2023年，2月20日，星期五Meaning?

M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即细胞分裂促进因子(mitosis-promotingfactor，MPF)。人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生。第5页，共53页，2023年，2月20日，星期五非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期。前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段。其中第Ⅳ期时细胞核较大，称为生发泡(germinalvesicle,GV)，此时细胞就停留在该时期，等待成熟。卵细胞提取物注射实验2促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）

第6页，共53页，2023年，2月20日，星期五1971年，Masui和Markert在体外用孕酮诱导非洲爪蟾的卵母细胞成熟第7页，共53页，2023年，2月20日，星期五Meaning?

：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，即促成熟因子MPF（maturationpromotingfactor）

。用成熟卵母细胞的细胞质注射到卵母细胞，发现可以促进卵母细胞成熟。第8页，共53页，2023年，2月20日，星期五1988年Maller实验室的J.Lohka纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。3MPF的纯化第9页，共53页，2023年，2月20日，星期五4细胞周期基因的发现LelandHartwell

七十年代初，美国西雅图的华盛顿大学LelandHartwell，

以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株，分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，cdc)。他发现的一群基因，成为八十年代和九十年代人们研究细胞周期的主要对象。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。第10页，共53页，2023年，2月20日，星期五

也在七十年代，英国牛津大学的PaulNurse，用另外一种酵母裂殖酵母为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2；通过对它们的分子生物学和生物化学研究，进一步的研究发现cdc2和cdc28的都编码一个34KD的蛋白激酶。这个酶的激活和失活调控细胞周期运转，特别是G2/M期转变。但研究者很快发现，p34cdc28

或p34cdc2单独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合）。第11页，共53页，2023年，2月20日，星期五PaulNurse和美国科罗拉多大学的Maller合作证明（1990）证明P32实际上是CDC2的同源物。第12页，共53页，2023年，2月20日，星期五13

1983年TimothyHunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，在下一个周期中又重复这一消长现象，故命名为周期素或周期蛋白cyclin

。随后cyclin很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。5细胞周期蛋白(cyclin)的发现第13页，共53页，2023年，2月20日，星期五TimHunt和Maller合作证明P45是cyclinB的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。PaulNurse(human-yeastgenes);TimHunt(cyclin)第14页，共53页，2023年，2月20日，星期五●催化亚基活性有赖于周期蛋白，故蛋白称为周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,Cdks);●调节亚基：周期蛋白(cyclin)。MPF的结构组成由两个不同的亚基组成的异质二聚体:第15页，共53页，2023年，2月20日，星期五LelandH.Hartwell

R.Timothy(Tim)Hunt

2001年诺贝尔生理学与医学奖授予了美国科学家LelandHartwell和英国科学家蒂TimHunt

、PaulNurse

，以表彰他们发现了细胞周期的关键调节机制。第16页，共53页，2023年，2月20日，星期五三、周期蛋白

自发现周期蛋白后，在不长的时间里有数十种周期蛋白被克隆和分离。如酵母的Cln1,Cln2,Clin3,Clb1-Clb6，在脊椎动物的A1-2、B1-3

、C、

D1-3、E1-2、F、G、H等。周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合.M期G1期第17页，共53页，2023年，2月20日，星期五

cyclinbox：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclinbox)，介导周期蛋白与CDK(cyclin–dependentkinase)结合。

Cyclin也含有降解盒（destructionbox）或PEST（脯氨酸－谷氨酸－丝氨酸－苏氨酸）序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚基的作用。第18页，共53页，2023年，2月20日，星期五已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。不同类型的CDK/cyclin复合体第19页，共53页，2023年，2月20日，星期五不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。

部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。第20页，共53页，2023年，2月20日，星期五

周期蛋白依赖性激酶(cyclindependentkinase)是指与周期蛋白结合才具有酶活性的激酶类。现已发现10余种。

在细胞周期中，CDK的表达量相对恒定，但以非活性的形式存在，在细胞周期特定的时间与周期蛋白特异地结合，一种CDK能与多种cyclin结合，以复合体的形式发挥作用。四、CDK激酶和CDK激酶抑制物第21页，共53页，2023年，2月20日，星期五CDKs是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，称为CDK1~9。第22页，共53页，2023年，2月20日，星期五

各种CDK分子在进化上高度保守，都含有一段类似的CDK激酶结构域，其中一段PSTAIRE的序列相当保守，与周期蛋白的结合有关。另外，都有多个磷酸化位点，位点的磷酸化与激酶的活性有关。第23页，共53页，2023年，2月20日，星期五这类蛋白激酶常以磷酸化的形式直接作用于细胞周期，包括DNA合成的启动和终止，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纤层的降解和重新聚合，纺缍体的形成和消失等。它们可根据作用的时期不同分为G1、G1/S、S期CDK，及M期CDK。第24页，共53页，2023年，2月20日，星期五第25页，共53页，2023年，2月20日，星期五时相蛋白激酶周期蛋白G2→MCdk1周期蛋白A，BG1→SCdk2周期蛋白ESCdk2周期蛋白A?Cdk3?G1

Cdk4周期蛋白D1，D2，D3G1

Cdk5周期蛋白D1，D2，D3G1

Cdk6周期蛋白D1，D2，D3哺乳动物细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶第26页，共53页，2023年，2月20日，星期五CDK催化活性的激活：①CDK与周期蛋白结合②保守苏氨酸残基磷酸化修饰CDK催化活性的抑制：①N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化②抑制蛋白与其结合(是主要的抑制性调节)CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。CDK的调节物包括：cyclin、CKI、CDK调节分子、CAK和磷酸酶等。CDK的活性调节第27页，共53页，2023年，2月20日，星期五

细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDK

inhibitor，CDKI）对细胞周期起负调控作用，目前发现的CDKI分为两大家族：

①Ink4(Inhibitorofcdk4)，如:P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，能专一性的与CDK4和CDK6结合，并阻止其与周期蛋白的结合反应，从而特异地抑制CDK4-cyclinD1、CDK6-cyclinD1复合物的活性，使细胞停留于G1期。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子第28页，共53页，2023年，2月20日，星期五P27—Cdkinhibitorproteins(CKIs)P27能与几乎所有的cyclin-CDK复合物结合，抑制其蛋白激酶活性，使细胞停留于G1期。其作用机制是抑制cyclinH-CDK7等CAK的活性。

②CIP/Kip(Kinaseinhibitionprotein)：包括P21cip/waf1(cyclininhibitionprotein1)、P27kip1(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，第29页，共53页，2023年，2月20日，星期五二、细胞周期运转调控CDK激酶对细胞周期起着核心性的调控作用。不同种类的周期蛋白和不同种类的CDK结合,构成不同的CDK激酶。不同的CDK激酶在细胞周期的不同时期表现出活性,因而对细胞周期的不同时期进行调节。第30页，共53页，2023年，2月20日，星期五Cdkassociatessuccessivelywithdifferentcyclinstotriggerthedifferenteventsofthecycle.Cdkactivityisusuallyterminatedbycyclindegradation.酵母细胞周期的调控第31页，共53页，2023年，2月20日，星期五哺乳动物细胞周期的调控

哺乳动物的细胞周期受一个小型Cdks家族的调节。在哺乳动物细胞周期中起作用的Cdks,Cdk1、Cdk2、Cdk3…等。哺乳动物细胞中也能表达多种周期蛋白:周期蛋白A、B、D和E。第32页，共53页，2023年，2月20日，星期五

细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合（一）细胞周期的启动G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶细胞由G1向S期转化受G1期周期蛋白依赖性激酶所控制：

G1期激酶：CDK4、CDK6

G1期周期蛋白：cyclinD,E。cyclinD的合成对细胞生长因子有强烈的依赖性第33页，共53页，2023年，2月20日，星期五第34页，共53页，2023年，2月20日，星期五Rb是G1/S期转化的负性调控因子,在G1晚期通过磷酸化而失活

Rb蛋白磷酸化→与之结合的转录因子（E2F）释放→S期所需的基因转录的阻断被解除→细胞进入S期；使P-Rb被磷酸化而失活，释放出转录因子E2F，E2F进入细胞核内，使促进G1期转入S期所需的调控基因开始转录。当细胞进入S期后，cyclinD被磷酸化后泛素化途径降解。第35页，共53页，2023年，2月20日，星期五第36页，共53页，2023年，2月20日，星期五周期蛋白E与CDK2结合，使之激活,使与RB类似的蛋白质底物p107

磷酸化而解除其对E2F的抑制作用，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。周期蛋白E在G1晚期表达,进入S期后降解.第37页，共53页，2023年，2月20日，星期五第38页，共53页，2023年，2月20日，星期五周期蛋白在CDK1激酶活性调节中的作用（二）G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用

在G2-M期，cyclinB在细胞周期G2的中晚期逐渐积累，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化(如组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件)，使得细胞进入M期。第39页，共53页，2023年，2月20日，星期五CDK1激酶的激活促进细胞进入分裂期

在S期,Weel1活性高，可以促进Thr14和Tyr15的磷酸化，Cdc25ｃ活性低。在Ｇ２期Cdc25ｃ活性增强，促进Thr14和Tyr15的去磷酸化CAK=CDK1-ActivitingKinase第40页，共53页，2023年，2月20日，星期五细胞中CDK1激酶的活性受到多种因素的调控第41页，共53页，2023年，2月20日，星期五CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与细胞的多种功能。第42页，共53页，2023年，2月20日，星期五cyclinB/A与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等下游细胞周期事件第43页，共53页，2023年，2月20日，星期五（三）M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化

细胞周期运转到中期后，M期周期蛋白A和B降解，CDK1激酶活性丧失，蛋白去磷酸化，由中期向后期转化。

CyclingA和CyclinB都是经依赖APC泛素化途径所降解。第44页，共53页，2023年，2月20日，星期五M期周期蛋白N端有破坏框。在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活泛素酶复合物，将泛素连接在M期周期蛋白上，导致其被蛋白酶体降解.第45页，共53页，2023年，2月20日，星期五

泛素(Ubiquitin)是由76个氨基酸组成的一种小蛋白，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。其主要功能是标记需要降解掉的蛋白质，使其被水解。蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋白质被降解的标签。

26S蛋白酶体(proteasome)是一个由70多个亚基组成的大型复合分子，分子量接近2,000KD，可识别泛素化的蛋白质，并将其降解成短肽。

泛素-蛋白酶体途径第46页，共53页，2023年，2月20日，星期五

需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，这一过程是一个三酶级联反应。

★泛素活化酶E1(ubiquitinactivatingenzyme)

★泛素结合酶E2(ubiquitinconjugatingenzyme)

★泛素连接酶E3(ubiquitin-proteinligase)，也称底物识别因子(substraterecognitionfactor)。蛋白分子泛素化

由于蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此，E3在整个蛋白质的降解过程中发挥了至关重要的作用，决定了反应的特异性。第47页，共53页，2023年，2月20日，星期五1.泛素的羧基端通过与泛素激活酶(E1)

的半胱氨酸残基形成硫酯键而激活。2.泛素从E1转移到泛素结合酶(E2)

的半胱氨酸残基。3.E2和泛素连接酶(E3)一起将泛素转移到底物蛋白的赖氨酸残基,在那里进行泛素