《烟草品种鉴定技术规程 SNP标记法》编制说明

《烟草品种鉴定技术规程SNP标记法》行业标准编制说明项目组2023年2月烟草品种鉴定技术规程SNP标记法编制说明.工作简况1.1任务来源国家烟草专卖局于2020年1月8日印发了《2020年度烟草行业标准项目计划（第一批）的通知》（国烟科[2020]17号），《烟草品种鉴定技术规程SNP标记法》作为行业标准制定计划下达，项目类别：YC/T，项目合同编号：2020B007。该项目为行业标准制定项目，归口技术委员会为农业分标委。1.2项目承担单位及主要分工承担单位为中国烟草总公司郑州烟草研究院、贵州省烟草科学研究院、云南省烟草农业科学研究院和中国农业科学院烟草研究所。中国烟草总公司郑州烟草研究院主要负责组织专家、协调分工、制定规范以及推广应用等工作；三家共同承担单位贵州省烟草科学研究院、云南省烟草农业科学研究院和中国农业科学院烟草研究所主要负责验证实验、制定规范以及推广应用等工作。1.3主要工作过程2019年项目组前期通过广泛调研，查阅整理相关文献资料，参考大作物中有关技术标准和方法，形成了项目整体思路和研究方法。2020年标准制定任务下达后，项目组明确了任务要求，研究讨论了标准制定的原则与方法，标准验证的方式与方法，在此基础上完成了标准的研制工作。2021年 组织贵州省烟草科学研究院、云南省烟草农业科学研究院和中国农业科学院烟草研究所等单位针对不同来源样本和不同类型烟草样本完成了标准的验证工作。2022年 组成了标准起草工作组，依据实验结果起草了标准初稿，针对标准的内容和规范进行了反复的讨论和分析，对有关问题进一步进行了完善和修订，形成了征求意见稿，拟征求行业意见。1.4标准主要起草人及其所做的工作项目负责人张剑锋负责相关文献资料调研、项目方案制定、实验验证以及标准文本的起草等工作；金静静、罗朝鹏、余世洲、任民、童治军、许亚龙、谢小东、武明珠、王中、卢鹏、徐馨等人参与了项目前期的基础工作，讨论确定了项目方案，完成了验证实验，并参与了标准文本的内容起草的讨论；杨军、曹培健、谢贺、白戈、肖炳光、杨爱国、雷波、杨志晓、赵会纳参与了项目的实验验证，并对标准文本的内容提出很多建设性意见。2.相关领域的国、内外标准研究和制修订情况烟草是一种重要的经济作物，在我国国民经济生产中占有重要地位。我国迄今为止育成（通过审定）的烤烟品种有180多个，现存的各类烟草种质资源5000余份，数量居世界之最。但是在烟草品种的鉴定和应用等方面与主要粮食作物相比还存在很大差距，尤其是DNA身份鉴定领域缺乏相应的检测标准。目前，我国烟草品种鉴定主要是基于品种特异性、一致性和稳定性（DUS）的评价鉴定体系，并于2015年制定了《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烟草》（NY/T2746-2015）。虽然形态学鉴定法简单、直观，但是该方法存在田间种植规模大、鉴别项目多（鉴别性状涉及株高、叶数、节距、叶长、叶宽、茎叶角度等）、周期长（跨越烟草不同生育期）、鉴别难度大（性状指标差异小）、同一性状年度间存在差异（受环境影响）等不足，同时鉴定结果还具有一定的主观性。此外，由于亲本的集中利用和定向人工选择造成我国烟草品种遗传背景狭窄，形态学鉴定难以区分微小的遗传变异。SNP(singlenucleotidepolymorphisms)是指在基因组上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。栽培烟草基因组大小约为4.5G，其中含有大量的重复序列，并且品种间遗传多样性低。正是由于烟草基因组的复杂性，使得烟草中分子标记开发难度大，多态性分子标记数量少。作为第三代分子标记，SNP相较之前的标记具有以下优势：1）精确性高，区分的差异是单个碱基的差异，数据重复率高；2）高通量，可以同时对成百上千的位点进行检测；3）覆盖广，SNP在基因组中广泛分布，极易筛选到分布于各染色体上的标记；4）自动化程度高，检测流程高度集成化、标准化，节约了人力物力，减少了人为读带误差导致的干扰。目前，国际植物新品种保护联盟（UPOV）、国际种子检验协会（ISTA）、国际种子联盟（ISF）等国际组织均将SNP标记作为品种身份鉴定和数据库构建的优选标记。2015年4月27日，农业部出台了《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》，明确要求以第三代分子标记SNP技术建立不同作物品种DNA身份鉴定体系构建及推广应用，解决品种身份鉴定、种质资源评价以及育种材料确权等难题。因此，建立基于SNP标记技术的烟草品种鉴定方法，可以进一步提高我国烟草品种鉴定技术的规范化和标准化水平，填补该方面研究的空白，有效提升我国烟草的品种创新和管理水平。3.标准编制原则及主要技术内容确定的依据3.1标准适用范围本文件规定了利用单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)标记进行烟草(NicotianatabacumL.)品种鉴定的操作程序、数据记录与统计判定方法。本文件适用于烟草品种的SNP指纹数据采集及品种鉴定。3.2标准编制原则根据农业部《农作物品种DNA身份鉴定体系构建实施方案》以及国际种子检验协会（ISTA）、国际植物新品种保护联盟（UPOV）和国际种子贸易联盟（ISF）等国际组织的研究动态、制定的指南，结合行业相关实验室装备水平和现有工作基础，充分考虑国内外该领域的发展水平和方向，制定技术先进、操作性强的烟草品种鉴定技术规程。3.3标准主要内容确定的依据本标准主要涉及推荐标记的筛选、样品类型选择、扩增产物检测和判定方法等。3.3.1标记标记的确定，主要经过以下几点：1）以国家烟草基因中心积累的基于259份不同烟草品种和种质的430K烟草高密度SNP芯片分型数据为基础，筛选获得了203430个PolyHighResolution类型SNP位点，其中123147个位于染色体上，71283个位于scaffold上；2）为了尽可能提高筛选SNP标记的检出效率（callrate），去除掉在任一样本中存在缺失（nocall）的标记，保留染色体上所有样本均能正常检出的90375个SNP。3）为了挑选烟草基因组上单倍型区域具有代表性的标记位点，利用生物信息学软件（Haploview）对所获得的染色体上的SNP标记根据连锁不平衡筛选具有标记性的SNP（tagSNP），得到15980个SNP标记；4）为了挑选多态性更高、适用范围更广的标记，针对tagSNP按照最小等位基因型频率（MAF）>0.3和杂合率（heterozygosity）<0.1进一步筛选获得3727个SNP标记；5）根据不同材料间的LD值（1.5Mb）和SNP标记的染色体分布特点，以1.5Mb为相对滑动区间窗口，最终筛选了2048个SNP标记，均匀分布于烟草24条染色体上。3.3.2样品类型在正常体细胞组织中，父母本等位基因型拷贝数多为1:1，均容易被检出。而种子胚乳中父母本等位基因型拷贝数不均衡，可能出现母本等位基因型丢失。为了避免这一问题，样品类型宜选用烟草叶、茎、根等以体细胞倍性为主的样品。结合幼嫩且新鲜的叶片组织提取的DNA量大且不容易降解，因此应该优先考虑此类。项目组分别利用田间采集的烟草叶片、根、茎样品以及种子培养皿萌发后采集的子叶样品利用DNA提取试剂盒进行样品DNA提取，电泳分析发现，相比于根和茎的样品，叶片样品和种子萌发后的子叶混合样品，DNA完整度更好。因此，我们优先推荐采集幼嫩组织叶片作为检测样品。若试验样品为种子时，其质量应符合GB/T21138中对烟草种子纯度的要求。可考虑进行种子萌发后采集幼嫩叶片组织进行检测，从烟草品种材料中抽取的个体的数量应满足NY/T2594要求。3.3.3DNA提取参照SNP芯片实验要求，提取与纯化的DNA溶液在260nm与230nm处的吸光度值的比值介于1.5与2.0之间；在260nm与280nm处的吸光度值的比值介于1.8与2.0之间；DNA电泳主带明显，无明显降解和RNA残留；DNA浓度>10ng/μL。项目组分别采用传统的CTAB法和DNA提取试剂盒进行烟草幼嫩叶片样本DNA提取，样本DNA均符合后续实验要求。因此，所获DNA质量能够符合扩增需要的提取方法都适用于本标准。3.3.4SNP分型检测SNP扩增产物检测方法较多，按照检测通量来划分可分为：1）传统的低通量SNP分型方法，如传统Sanger测序方法、限制性内切酶酶切法等，由于速度慢、自动化程度差等，仅适合样本量和位点数较少的检测；2）中通量的SNP分型方法，如TaqMan、质谱法等，由于通量少、性价比较低，仅适合大样本量几个位点的检测；3）高通量的SNP分型方法，如SNP芯片、ArrayTape和KASP等检测方法，由于高度自动化、高通量和高准确性，适合适合样本量和位点数均可选的检测。结合行业相关实验室装备水平和现有工作基础，充分考虑国内外该领域的发展水平和方向，因此本标准推荐芯片检测方法。按照基因组DNA变性、扩增、片段化、沉淀、干燥和重悬、杂交、连接、洗涤、染色和扫描的流程完成SNP芯片分型实验。3.3.5数据记录按照DishQC值>0.82，QCcallrate值>0.97进行芯片实验质控，选择质控合格的样品，提取筛选获得的2048个SNP标记对应的样品基因型。根据SNP位点的分型效果，剔除或留用该位点的数据。数据记录为X/X或X/Y，其中X、Y为该位点的单核苷酸，如A、T、C、G，按此顺序排列。无效数据记录为-/-。为确保样品检测结果比对准确可靠，当一个样品的有效数据所占比例<95%时，该样品数据结果建议不予采用。利用样品的有效数据构建该样品的指纹图谱。3.3.6判定方法当前关于作物品种鉴定的判定方法通常采用差异位点数或者遗传相似度来进行比较。由于本标准采用的SNP标记数量较多，更适合采用遗传相似度，即以品种间的遗传相似比值来表示两个品种间的差异性。遗传相似度GS=nij/Nij×100%，其中GS表示检测样品与对照品种的遗传相似度（%），nij表示检测样品与对照品种中均检出的但基因型无差异的标记位点的数目，Nij表示待测品种与对照品种中均检出的标记位点的数目。为了有效进行样品的身份鉴定，项目组对遗传相似度的判定阈值进行了综合分析。首先选择了国家烟草基因中心前期从不同省份不同烟叶产区采集的3个品种（K326、红花大金元、云烟87）各8个单株叶片样品进行独立分型测试，发现其品种内变异均大于96%；与此同时，针对259份烟草品种和种质SNP分型数据，通过数据质控、存疑数据清洗、相同品种材料合并，整理后发现在剩余的202份材料中两两品种间遗传相似度大部分低于96%（比例为98.6%），遗传相似度>96%的材料中主要为地方种质资源。因此认为当样品间遗传相似度≤96%，则可判定为“不同品种”；当样品间遗传相似度＞96%，判定为“近似品种或疑同品种”。对于“近似品种或疑同品种”的样品，可按NY∕T2746-2015的规定进行田间种植进一步鉴定。3.4本标准与被修订标准在标准技术内容、水平方面的对比情况本标准为新制订标准，不涉及相关内容。4.标准预期产生的社会、经济效益建立基于SNP标记技术的烟草品种鉴定方法，能够在DNA分子水平上有效区分不同烟草品种，进一步提高我国烟草品种鉴定技术的规范化和标准化水平，有效提升我国烟草的品种创新和管理水平。5.采用国际标准和国外先进标准的情况无，未见相关国际标准。6.与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系国内暂无相关强制性标准，与有关的现行法律、法规和强制性标准无抵触关系。7.重大分歧意见的处理经过和依据本标准在充分征求各方意见的基础上形成，编制过程中无重大分歧意见。8.作为强制性标准或推荐性标准的建议及主要依据建议作为推荐性烟草行业标准予以发布实施。我国烟草种植面积世界第一、烟草种质资源保存量世界第一，但是在烟草品种和种质资源的鉴定和应用等方面与主要粮食作物相比还存在很大差距，尤其是DNA身份鉴定领域缺乏相应的检测标准。根据国家《种业振兴行动方案》和烟草行业中长期、“