基于全局转录工程策略构建吡咯喹啉醌生产菌,基因工程论文

基于全局转录工程策略构建吡咯喹啉醌生产菌,基因工程论文吡咯喹啉醌(PQQ)是异于NAD/NADP和FMN/FAD的新型辅酶,能刺激微生物生长、促进神经细胞和生长因子的合成、调节机体自由基水平、保卫脑功能、加强对毒性和辐射的耐受性,并且有望成为治疗帕金森病的候选药物。迄今发现能合成PQQ的生物主要是革兰氏阴性菌,包括副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乙酸钙不动杆菌属(Acinetobactercalcoaceticus)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)、甲基芽孢杆菌属(Methyloba-cillus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)等。但绝大多数菌株发酵产率低,难以实现工业化。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的PQQ合成牵涉6个基因构成的基因簇(pqqABCDEF)。当前PQQ的合成机制尚未完全说明,定向改造其代谢途径存在难度。

全局转录工程(gTME)是用易错PCR对RNA聚合酶的亚基或其他转录元件进行突变,通过改变亚基与启动子区域的亲和力,进而影响基因的转录程度。亚基的突变文库能结合大量启动子,可在转录组水平上大范围地影响基因转录,进而导致细胞代谢流量再分配,是一种全新的分子育种策略。据报道K.pneumoniae的因子包括rpoD、rpoE、rpoH、rpoN、rpoS等,华而不实rpoD为首要因子。转录经过中,提高RNA聚合酶对启动子区域的亲和力,可加强转录的强度。本文基于gTME策略,通过易错PCR构建rpoD基因的突变库,与载体连接后电转化K.pneumoniaDSM2026构建突变菌株,从大量重组子中挑选PQQ高产菌。

1、材料与方式方法

1.1材料

1.1.1菌株与载体

肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniaDSM2026)及表示出载体pET-PK由本实验室保存和构建,华而不实PK代表甘油脱水酶基因(GenBankU30903)本身的启动子。肺炎克雷柏氏菌PQQ基因簇示意图如此图1。

1.1.2培养基与试剂

LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,氯化钠10,pH7.0。LB固体培养基需参加1.5%的琼脂。发酵培养基:5M9盐溶液200mL,1mol/LMgSO42mL,20%葡萄糖20mL,1mol/LCaCl20.1mL,加灭菌的去离子水至1000mL。5M9盐溶液(g/L):Na2HPO47H2O64,KHPO415,NaCl2.5,NH4Cl5.0。NBT-Gly溶液:20mmol/L磷酸盐缓冲液PBS(0.2mol/LNa2HPO4,0.2mol/LNaH2PO4,pH7.0),NBT-GlyK+溶液(预先配制2mol/LGly-KOH溶液,pH10),使用时参加氯化硝基四氮唑蓝(NBT),终浓度为0.24mmol/L。

1.2实验方式方法

1.2.1扩增目的基因rpoD

在NCBI查得K.pneumoniae的rpoD基因序列(GenBankACI07699),设计引物,以K.pneumoniae基因组为模板,进行PCR,扩增rpoD基因。上游引物的酶切位点为EcoRI,下游引物的酶切位点为SalI,下划线序列为引入的酶切位点。

1.2.2转化重组质粒

将切胶回收的rpoD基因和pET-PK表示出质粒用EcoRI和SalI于37℃下酶解2h,用T4DNA连接酶16℃连接过夜,构建对照组rpoD的重组质粒pET-PK-drpoD。将该重组质粒电转化感受态的K.pneumoniaDSM2026,复苏后涂布于含卡那霉素的LB固体培养基,37℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR和质粒双酶切鉴定。阳性克隆命名为K.p(pET-PK-drpoD),华而不实drpoD意指未进行突变的rpoD基因。

1.2.3构建突变库

以rpoD基由于模板进行易错PCR,反响体系25L:TaqDNA聚合酶缓冲液2L,上下游引物均为0.5L,模板0.5L,dATP和dGTP0.2mmol/L,dCTP和dTTP0.6~1mmol/L,Mg2+2~4mmol/L,rTaqDNA聚合酶0.4L。易错PCR反响参数为95℃3min,94℃1min,55℃50s,72℃2min,进行30个循环;72℃10min,16℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

将切胶回收突变rpoD基因和表示出质粒pET-PK用EcoRI和SalI于37℃下酶解2h,T4DNA连接酶连接过夜,构建重组突变质粒pET-PK-trpoD,得到突变文库,华而不实trpoD意指突变的rpoD基因。

1.2.4转化重组突变质粒及挑选阳性克隆

将重组突变质粒pET-PK-trpoD电转化感受态的K.pneumoniaeDSM2026,复苏后涂布于含卡那霉素的LB固体培养基,37℃培养过夜,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。

1.2.5重组菌发酵

对照菌K.p(pET-PK-drpoD)及重组菌K.p(pET-PK-trpoD)进行24h摇瓶发酵,设置3组平行,每隔3h取发酵液,测定吸光度,绘制生物量曲线。

1.3分析方式方法

采用NBT-Gly法定性检测PQQ。300L反响体系包括20LPQQ发酵液,80LPBS,180LGly-KOH,20LNBT,30℃避光反响1h。吸打混匀后参加到96孔酶标板,以去离子水代替发酵液作对照,在波长530nm下测吸光度A,PQQ产量与A值成正比。提取重组菌K.p(pET-PK-trpoD)的质粒进行测序。

2、结果与讨论

2.1对照菌K.p(pET-PK-drpoD)的构建

以K.pneumoniae基因组为模板PCR扩增rpoD基因,如此图2所示,在2000bp左右出现条带,与GenBank颁布的rpoD基因(1842bp)相符。将重组质粒pET-PK-drpoD电转化至感受态K.pneumoniaeDSM2026,涂布平板培养后挑取单菌落进行培养,提取质粒进行双酶切鉴定,得到质粒pET-PK(约5400bp)和rpoD基因条带(约1800bp),证明重组质粒pET-PK-drpoD成功转化到K.pneumoniaeDSM2026中。

2.2突变库的构建

以rpoD基由于模板,进行易错PCR反响。如此图3所示,泳道1~10所含dCTP和dTTP浓度相等,华而不实泳道1、4、7、10浓度为1mmol/L,泳道2、5、8浓度为0.8mmol/L,泳道3、6、9浓度为0.6mmol/L。除此之外泳道1~3Mg2+浓度为4mmol/L,泳道4~6Mg2+浓度为3mmol/L,泳道7~10Mg2+浓度为2mmol/L。从产量上看,以泳道3的条件为最优。用大体系(100L),最佳条件进行易错PCR反响,切胶回收PCR产物,纯化后的突变rpoD基因和pET-PK表示出质粒用EcoRI和SalI于37℃下酶解2h,T4DNA连接酶16℃连接过夜,构建重组突变质粒pET-PK-trpoD。将重组突变质粒pET-PK-trpoD电转化K.pneumoniaeDSM2026,得到突变文库。

2.3重组菌阳性克隆的挑选

将突变质粒pET-PK-trpoD电转化到感受态的K.pneumoniaeDSM2026,涂布培养,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定(图4),电泳显示大约1800bp处有条带,证明重组突变质粒pET-PK-trpoD已转化至K.pneumoniaeDSM2026中。

2.4重组菌发酵生产PQQ

重组菌K.p(pET-PK-trpoD)的生物量曲线如此图5所示。在对数生长期其生长速度和生物量明显快于对照菌K.p(pET-PK-drpoD),发酵3h后进入平稳期,表示清楚发生突变的rpoD影响了相关基因的表示出,有利于细胞生长和代谢;进入平稳期后重组菌生长速度和生长量与对照菌基本持平,揣测是对数生长期PQQ的过表示出消耗了大量葡萄糖,进而无法维持菌体的对数生长。

重组菌K.p(pET-PK-trpoD)的PQQ产量如此图6所示。从第3h开场重组菌的PQQ高于对照菌,且其最高产量到达76mg/mL,比对照菌提高了约10%。这是由于rpoD基因的突变扰动了胞内基因的转录,代谢流发生重排,强化了PQQ的合成途径。由于辅酶与酶蛋白之间存在严谨的依存关系,微量辅因子即能极大扰动整个细胞代谢,因而PQQ远不可能到达乙醇和乳酸那样的产量。

将突变rpoD基因测序结果与GenBank中的rpoD基因序列进行ClustalW2程序比对,发现1842个碱基中的突变碱基为46个,无碱基缺失现象。翻译出的氨基酸残基中有3个发生了突变,分别为D200E、E332G、T569A,突变率为0.5%,如此图7。

用SOPMA在线程序(http:∥expasy.ch/tools)对突变后rpoD蛋白质的二级构造进行预测并与突变前相比,发现突变前螺旋、伸展链、转角和无规则卷曲的数目分别为424、31、31、127,突变后的相应数目分别为418、38、31、126,可见突变的3个氨基酸残基对二级构造产生了较大影响,进而影响了RNA聚合酶对启动子的亲和