大肠杆菌中鸡SP-A蛋白的表达及其生物学活性(2),分子生物学论文

大肠杆菌中鸡SP-A蛋白的表达及其生物学活性(2),分子生物学论文

通过RT-PCR成功地从鸡肺组织mRNA中扩增出预期大小的目的条带。将该PCR产物连接入pMD19-T载体中，阳性克隆被命名为pMDT-cSPA.测序结果发现，该基由于cSP-A,与GenBank中登录的序列〔登录号：AF411083〕的同源性为100%.为便于在大肠杆菌中表示出，剪去其信号肽部分，以pMDT-cSPA质粒为模板，以cSPA-55F和cSPA-R为上、下游引物扩增出cSP-A成熟肽基因，双酶切PCR产物，再克隆入原核表达载体pCold-TF中。经PCR鉴定和测序，结果成功构建了表示出cSP-A成熟肽基因片段的原核表示出载体，遂将其命名为pCold-cSPA〔见图1〕。

2.2重组蛋白的表示出和纯化

在16℃培养条件下，分别经终浓度为0.1、0.2、0.5和1mmol/LIPTG诱导pCold-cSPA24h,SDS鉴定发现：用终浓度为1mmol/LIPTG诱导菌，pCold-cSPA的表示出量相对较大，表示出产物大小约为80ku〔见图2A〕。随后，利用1mmol/LIPTG大量诱导阳性克隆菌200mL,经超声波裂解后，融合蛋白主要以上清形式存在〔见图2B〕。取表示出上清参加到平衡好的HisTag树脂中，表示出上清与树脂悬液的比例约为5∶1;最后分段收集洗脱液，取少量进行SDS检测，结果成功获得纯化的cSP-A融合蛋白〔见图3〕。

2.3Western-blot分析

用抗cSPA-CRD小鼠多克隆抗体血清对纯化后的cSP-A蛋白进行Western-blot检测。结果显示，在80ku处出现单一的特异性条带〔见图4〕，表示清楚诱导表示出的cSP-A重组蛋白能被抗其多克隆抗体特异性辨别。

2.4抑菌活性检测

采用单层琼脂平板扩散法检测原核表达的cSP-A蛋白对各个指示菌的抑菌情况，结果〔见图5〕显示，阳性对照〔即天然cSP-A蛋白和卡那霉素〕对巴氏杆菌、大肠杆菌〔CMCC44102〕、甲型副伤寒沙门菌〔ATCC9150〕、金黄色葡萄球菌〔ATCC25923〕、粪肠球菌〔CMCC29212〕均有一定的抑菌活性，但原核表示出的cSP-A蛋白没有明显的抑菌活性。

3讨论

与哺乳动物源SP-A比拟，发现cSP-A有以下4点不同。第一，CLR区不完好，仅包括一个胶原样G-X-Y三联体重复序列，有趣的是，同样定位于鸡6号染色体上的鸡肺凝集素〔chickenlunglectin,cLL〕在基因构造上无CLR区[8],但重组cLL蛋白能抑制人H3N2和H1N1亚型流感病毒的血凝活第11期黄琪等：鸡肺外表活性蛋白A的可溶性表示出及活性检测性[9],提示CLR区完好性对其凝集活性的影响不大。第二，通过软件模拟cSP-A空间构造发现，尽管cSP-A的茎区较短，但其与猪、人源的SP-A的单体构造极其类似，似乎并不影响空间构造的构成。第三，多出了一个未知区，由54aa组成，这一区域的功能有待确定。第四，CRD区不仅有2个糖基化位点，2个钙离子结合位点，还有1个结合甘露糖的基序〔215EPN217〕，这一基序可能会使CRD结合病原微生物糖蛋白的作用更为显着[10].基于这四点不同，有必要对cSP-A的全基因进行表示出并进而获得大量可溶性cSP-A蛋白纯品，以研究其基因构造与生物学功能的关系，并期望将来用于临床研究。

原核表示出系统是获取大量蛋白质的最直接途径，但是cSP-A全基因中有多个大肠杆菌的稀有密码子。为此，笔者曾尝试多种原核表示出载体进行表示出，但均未获得成功，只要在表示出cSP-A基因的部分片段〔例如N端区和C端CRD区〕，且突变了大肠杆菌的稀有密码子后才获得了高效表示出，但表示出产物均为包容体，不宜进行生物活性的研究。为此，本研究选择pCold-TF原核表示出载体，该表示出载体带有冷休克蛋白A〔cspA〕启动子，融合触发因子〔TF〕、蛋白质水解位点和His标签分子，在低温环境中经IPTG诱导表示出，不仅可加强目的蛋白的稳定性，而且有效促进融合蛋白的可溶性表示出，便于蛋白质纯化，保证目的蛋白的天然活性[11].最终研究结果显示，cSP-A成熟肽在该载体中获得了高效可溶性表达；Western-blot结果显示，该蛋白质可被cSPA-CRD多克隆抗体特异性辨别，表示清楚cSP-A重组蛋白具有良好的反响原性〔见图4〕。

cSP-A与哺乳动物源SP-A序列的同源性不高，本研究通过抑菌试验证明：cSP-A蛋白原核表示出产物无明显抑菌功能，而天然鸡肺灌洗液SP-A蛋白可高效抑制部分常见革兰阴性菌〔巴氏杆菌、甲型副伤寒沙门菌、大肠杆菌〕和革兰阳性菌〔粪肠球菌、金黄色葡萄球菌〕〔见图5〕。这可能与原核表示出产物没有天然蛋白的翻译后修饰，也不能构成三聚体，进而不能发挥天然蛋白的类似活性所致。下一步将通过cSP-A全长真核分泌性表示出、杆状病毒载体真核表示出系统等途径解决其生物学活性问题。

以下为参考文献〔References〕

[1]BERNHARDW,GEBERTA,VIETENG,etal.Pulmonarysurfactantinbirds:copingwithsurfacetensioninatubularlung[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol,2001,281〔1〕：327-337.、

[2]VELDHUIZENEJ,VANEIJKM,HAAGSMANHP.Thecarbohydraterecognitiondomainofcollectins[J].FEBSJ,2018,278〔20〕：3930-3941.

[3]刘红梅，崔尚金，潘玲，等。鸡肺相关凝集素及其天然免疫机制[J].中国免疫学杂志，2020,29〔3〕：327-330.LIUHong-mei,CUIShang-jin,PANLing,etal.Chickenlung-associatedlectinanditsinnateimmunedefensemechanisms[J].ChineseJournalofImmunology,2020,29〔3〕：327-330.〔inChinese〕

[4]SILVEYRAP,FLOROSJ.Geneticcomplexityofthehumansurfactant-associatedproteinsSP-A1andSP-A2[J].Gene,2020,531〔2〕：126-132.

[5]SULLIVANLC,DANIELSCB,PHILLIPSID,etal.Con-servationofsurfactantproteinA:evidenceforasingleoriginforvertebratepulmonarysurfactant[J].JMolEvol,1998,46〔2〕：131-138.

[6]刘红梅，王浩，邵颖，等。鸡肺外表活性蛋白A的表示出及其多克隆抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志，2020,30〔1〕：63-66.LIUHong-mei,WANGHao,SHAOYing,etal.ExpressionofchickenpulmonarysurfactantproteinAandpreparationofitspolyclonalantibody[J].ChineseJournalofCellularandMo-lecularImmunology,2020,30〔1〕：63-66.〔inChinese〕

[7]KARBANIN,DODAGATTA-MARRIE,QASEEMAS,etal.PurificationofnativesurfactantproteinSP-Afrompooledamnioticfluidandbronchoalveolarlavage[J].MethodsMolBiol,2020,1100:257-272.

[8]AWASTHIS,MADHUSOODHANANR,WOLFR.Surfac-tantprotein-Aandtoll-likereceptor-4modulateimmunefunc-tionsofpretermbaboonlungdendriticcellprecursorcells[J].CellImmunol,2018,268〔2〕：87-96.

[9]HOGENKAMPA,ISOHADOUTENN,REEMERSSS,etal.ChickenlunglectinisafunctionalC-typelectinandinhibitshaemagglutinationbyinfluenzaAvirus[J].VetMicrobiol,2008,130〔1-2〕：37-46.

[10]FOSTERMW,THOMPSONJW,LEDFORDJG,etal.Identi-ficationandquantitationofcodingvariantsandisoformsofpulmonarysurfactantproteinA[J].JProteomeRes,2020,13〔8〕：3722-3732.

[11]廖文艳，马得莹，韩宗玺，等。重组鸡-防御素10蛋白的原核表示出及其抗菌活性的测定[J].中国预防兽医学报，2008,30〔10〕：765-769.LIAOWen