苯丙酮尿症致病基因新发突变的生物信息学探究,生物技术论文

苯丙酮尿症致病基因新发突变的生物信息学探究,生物技术论文由于本研究中的3例突变分别发生在外显子1、外显子6和外显子11上，而外显子1因其序列太短未找到同源序列，因而将外显子1,2结合起来对外显子1处发生的点突变(c.59AC,60GC)进行同源建模，并对突变后的外显子6和外显子11分别进行同源建模，见图2。华而不实，图2A是正常的外显子1,2构造，图2B是点突变(c.59AC,60GC)突变后的外显子1,2预测构造，能够看出突变导致外显子的一处片层消失。图3A是正常的外显子6的空间构造，图3B中由于(c.690-691insG)，导致移码突变S231fsX51，即该三联密码子下游第51位氨基酸处蛋白合成终止，致使外显子6的空间构象发生明显改变。外显子11上的第1119位和1120位插入碱基T(c.1119-1120insG)，导致移码突变I374fsX，即374位后第20位氨基酸处蛋白合成终止，由于此处突变可能会影响外显子12和13的合成，因而选择从正常的外显子10开场到外显子13进行同源建模，同时对(c.1119-1120insG)突变后的外显子10之后的部分进行同源建模。图4A是正常的外显子10,11,12,13的构造;图4B是正常的外显子10,11的构造;图4C是(c.1119-1120insG)突变后外显子10,11,12,13的构造，能够看出(c.1119-1120insG)的突变导致外显子11三级构造部分缺失。2.3PAH新发剪接突变的生物学效应分析经3种生物信息学软件综合分析上述突变，CRYP-SKIP预测值中，PCR-E(在右边的刻度盘上用红色指针表示)取值介于0和1之间，较高的值表示支持隐蔽剪接位点激活，较低值则表示支持外显子跳跃。突变预测结果显示c.441+2TA突变后第4外显子5端产生隐蔽剪接位点(PCR-E)的可能性为0.35,3端的值接近于0,c.842+4AT突变后第7外显子5端产生隐蔽剪接位点(PCR-E)的可能性为0.39,3端的值接近于0。c.1200+1TG突变后外显子11中5端产生隐蔽剪接位点(PCR-E)的可能性为0.66,3端的值接近于0。BDGP显示正常PAH基因第4内含子5端剪接位点(AGgt,g为突变处)的预测值为0.94(预测值为0～1),c.441+2TA突变后第4内含子5端剪接位点(AGgt,g为突变处)的预测值则为0.96(预测值为0～1)，而IVS4+2TA和IVS7+4AT突变后BDGP预测值均消失(预测值为0)。HSF预测中CV值高于80者具有较强剪接信号，CV值为70～80的剪接位点剪接信号较弱，少部分剪接位点的CV值为65～70[9](预测值为0～100)。预测结果显示c.441+2TA使第4内含子的5剪接供体共鸣值(CV值)由正常的83.22变为56.39。c.842+4AT使第7内含子的5剪接供体CV值为由82.11变为73.32，而3剪接受体CV值由68.35变为39.4。c.1200+1TG突变使第11内含子的5剪接供体CV值为由95.95变为69.12，而3剪接受体CV值并无明显变化。图2外显子1,2的同源建模结果A:正常的外显子1,2构造;B:外显子1处点突变突变后的预测构造图3外显子6的同源建模结果A:正常外显子6的空间构造;B:外显子6空间构象发生改变图4外显子10-13的同源建模A:正常的外显子10,11,12,13的构造;B:正常的外显子10,11的构造;C:突变后外显子10,11,12,13的构造3讨论一般以为，PKU是由于PAH基因突变引起PAH蛋白功能损坏或丧失而导致的，PAH基因中细微的改变都会引起酶蛋白三维构造的改变，并可造成PAH活性降低甚至完全丧失，导致在临床上产生PKU病患。而PAH蛋白的三级构造是一个同源四聚体。此前对于PKU基因型与表型关系的研究多是利用质谱技术和X射线衍射技术构建PAH的3D晶体构造模型来进行的[10]，而最新研究发现了全长哺乳动物(大鼠)PAH的第1个X射线晶体构造[11]。本研究中使用Swiss-model对1例错义突变和2例插入突变所在的第1、第6和第11外显子的同源建模分析中发现(c.59AC,60GC)突变导致外显子1,2区域的片层构造消失，另外此突变位于外显子与内含子的交界处，可能会严重影响PAH基因后续的转录、翻译和蛋白折叠等[6]。(c.690-691insG)突变导致外显子6的空间构象发生改变;而外显子11上的(c.1119-1120insG)突变不仅影响了外显子11的空间构象，并且严重影响了后续外显子12和外显子13的构象，这3例突变预测的结果显示突变会直接影响PAH单体的构造完好性。而近期有研究揭露PKU相关的基因突变会对PAH同源四聚体的稳定性产生影响，造成PAH蛋白不同程度的降解，进而导致严重的PKU表型[12]。例如PAH基因R408W突变后导致翻译的蛋白质极易降解，最终在患者体内或体外测不出PAH，进而导致严重的PKU表型，而R413P突变则导致PAH四聚体构造的高度不稳定，影响正常的单体状态和蛋白酶的功能，临床表现为严重代谢障碍型PKU。所以作者大胆揣测，这3例突变甚至有可能导致突变体的稳定性遭到影响，致使PAH蛋白降解，进而影响其功能。当前，在PKU相关的PAH基因缺陷中，约13%的突变影响保守的3和5剪接位点，而大多数报道的剪接突变都是通过影响5端剪接供体位点进而引起疾病的[13]。本研究中对于3种剪接突变的多种预测结果显示，第7内含子处的c.842+4AT突变可能导致外显子的3端发生了跳跃，第4内含子的c.441+2TA突变和第11内含子处c.1200+1TG的突变都有可能是由于外显子的5端影响剪接，华而不实第4内含子的c.441+2TA突变可能原因是其5端发生了跳跃。在近期一项PAH基因外显子11处两个致病剪接突变(c.1199+17GA和c.1199+20GC)的研究中发现，与5剪接位点相结合的小核糖核蛋白颗粒U1snRNA在与外显子11的剪接经过中起着重要作用，而突变则会毁坏U1snRNA和内含子5剪接位点的结合，进而影响剪接。除此之外还证明了通过修饰U1snRNA能够实现对剪接突变的校正[14]。本研究中第11内含子处c.1200+1TG突变的预测结果讲明，突变可能降低了11内含子5端隐蔽剪接位点的活性，但c.1200+1TG突变能否同样毁坏U1snRNA和内含子5剪接位点的结合还不得而知，需要进一步的实验验证。尽管本研究采用生物信息学方式方法对PAH基因突变进行了分析，但基因突变对功能的影响是一个复杂的经过，且生物信息学方式方法还有待提升，详细的基因突变与功能的关系及突变后的机制还要以实验结果为准，这需要后续进一步的系统研究。以下为参考文献[1]FLLINGA.Uberausscheidungvonphenylbrenztraubensaureindenharnalsstoffweshselanomalieinverbindungmitimbezillitat[J].Hoppe-SeylersZPhysiolChem,2018,277(1/4):169-181.[2]YILDIZY,DURSUNA,TOKATLIA,etal.Partialhydatidiformmoleinaphenylketonuriapatienttreatedwithsapropterindihydrochloride[J].GynecolEndocrinol,2021,33(1):19-20.[3]WOOSL,LIDSKYAS,GUTTLERF,etal.Clonedhumanphenylalaninehydroxylasegeneallowsprenataldiagnosisandcarrierdetectionofclassicalphenylketonuria[J].Nature,1983,306(5939):151-155.[4]LEKM,KARCZEWSKIKJ,MINIKELEV,etal.Analysisofprotein-codinggeneticvariationin60,706humans[J].Nature,2021,536(7616):285-291.[5]BLAUN.Geneticsofphenylketonuria:thenandnow[J].HumMutat,2021,37(6):508-515.[6]张志，何蕴韶．苯丙酮尿症分子遗传学研究进展[J]．遗传，2004,26(5):729-734.[7]唐新华，陈红，章印红，等．云南地区汉族苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变的研究[J]．中华医学遗传学杂志，2021,32(2):153-157.[8]DIVINAP,KVITKOVICOVAA,BURATTIE,etal.Abinitiopredictionofmutation-inducedcrypticsplice-siteactivationandexonskipping[J].EurJHumGenet,2018,17(6):759-765.[9]DESMETFO,HAMROUND,LALANDEM,etal.HumanSplicingFinder:anonlinebioinformaticstooltopredictsplicingsignals[J].NucleicAcidsRes,2018,37(9):e67.[10]KOBEB,JENNINGSIG,HOUSECM,etal.Structuralbasisofautoregulationofphenylalaninehydroxylase[J].NatStructBiol,1999,6(5):442-448.[11]ARTUROEC,GUPTAK,HROUXA,etal.Firststructureoffull-lengthmammalianphenylalaninehydroxylaserevealsthearchitectureofanautoinhibitedtetramer[J].ProcNatlAcadSciUSA,2021,113(9):2394-2399.[12]SCHELLERR,STEINA,NIELSENSV,etal.Towardmechanisticmodelsforgenotype-phenotypecorrelationsinphenylketonuriausingproteinstabilitycalculations[J].HumMutat,2022,40(4):444-457.[13]KRAWCZAKM,THOMASNS,HUNDRIESERB,etal.Singlebase-pairsubstitutionsinexon-intronjunctionsofhumangenes:nature,distribution,andconsequence