第七章-微生物的遗传变异与育种VIP

第七章微生物的遗传变异与育种第一节遗传变异的物质基础其次节基因突变和诱变育种第三节基因重组和杂交育种第四节基因工程第五节菌种的衰退、复壮与保藏志向的工业发酵菌种应符合以下要求：①遗传性状稳定；②生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；③目标产物的产量尽可能接近理论转化率；④目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分别；⑤尽可能削减产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并利于分别；⑥培育基成分简洁、来源广、价格低廉；⑦对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；⑧对溶氧的要求低，便于培育及降低能耗。遗传与变异的概念遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形态的遗传信息。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；------是一种内在可能性或潜力。遗传型+环境条件表型表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;------是一种现实存在，是具确定遗传型的生物在确定条件下所表现出的具体性状。代谢发育变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生变更。变异的特点：a.在群体中以极低的几率出现，（一般为10-6～10-10）；b.形态变更的幅度大；c.变更后形成的新性状是稳定的，可遗传的。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构变更而只发生在转录、转译水平上的表型变更。特点是：a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变更；b.性状变更的幅度小；c.因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消逝后，表型即可复原。例如：粘质沙雷氏菌：在25℃下培育，产生深红色的灵杆菌素；在37℃下培育，不产生色素；假如重新将温度降到25℃，又复原产色素的实力。遗传与变异的概念微生物的独特生物学特性：（1）个体的体制极其简洁；（2）养分体一般都是单倍体；（3）易于在成分简洁的组合培育基上大量生长繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6）菌落形态特征的可见性和多样性；（7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的干脆性和均一性；（8）易于形成养分缺陷型；（9）各种微生物一般都有相应的病毒；（10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微生物是探讨现代遗传学和其它很多主要的生物学基本理论问题中最热衷的探讨对象。对微生物遗传规律的深化探讨，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作供应了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。探讨微生物遗传学的意义第一节遗传变异的物质基础种质连续理论：1883－1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：1933年摩尔根（ThomasHuntMorgan）发觉了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演化出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简洁得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为确定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为试验对象进行的三个著名试验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。1928年，Griffith进行了以下几组试验：（1）动物试验

对小鼠注射活RII菌或死SIII菌————小鼠存活

对小鼠注射活SIII菌————————小鼠死亡

对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌———小鼠死亡

抽取心血 分别

活的SIII菌一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典试验（一）经典转化试验（transformation）：F.Griffith，探讨对象：Streptococcuspneumoniae（肺炎双球菌）SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性Griffith转化试验示意混合培育RII型活菌SIII型活菌SIII型热死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死（2）细菌培育试验（3）S型菌的无细胞抽提液试验以上试验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。热死SIII菌—————不生长

活RII

菌—————长出RII菌

热死SIII菌—————长出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培育①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白质⑥加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。（二）噬菌体感染试验A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染试验（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含75%放射性（三）植物病毒的重建试验为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建试验。将TMV在确定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分别。分别后的RNA在没有蛋白质包袱的状况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分别出正常病毒粒子。

选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：

（1）RNA（TMV）­蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）­蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分别到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分别到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。（一）核酸存在的七个水平及质粒细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平:倍性(真核)和染色体数核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或袒露，双链或单链基因水平：具自主复制实力的遗传功能单位，长度与信息量，转录——翻译密码子水平： 信息单位,起始和终止,核苷酸水平： 突变或交换单位，四种碱基二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式核外DNA的种类核外染色体真核生物的“质粒”原核生物的质粒

线粒体细胞质基因 叶绿体（质体） 中心体 动体共生生物： 卡巴颗粒酵母菌的2m质粒F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒基因：能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。原核生物基因系统： 启动子（基因） 操纵子 操纵子（基因）基因调控系统 结构基因 调整基因CABSummaryA:RNApolymeraseB:lacrepressorC:CRP-cAMP细胞水平：大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同染色体水平：真核微生物的每个细胞核内含有确定数量的染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个袒露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。一些真核生物和原核生物基因组的比较生物单倍体的分子量核苷酸已知染色体数约数（Da）对数基因数人 32 3－5×10125－7×109

－4000

黑腹果蝇4 7.9×10108.0×1075000－6000粗糙脉孢菌 7 2.8×10104.5×107>500

大肠杆菌 1 2.5×109 3.8×106

－1027

噬菌体T4 1 1.1×108 2.0×105

－135

噬菌体 1 3.2×1074.8×104

－35噬菌体MS2 1 1.1×1063.5×103 3 遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列依次密码子（coden）：由3个核苷酸依次确定，负载遗传信息的基本单位不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子：UAA、UGA、UAG质粒：细菌染色体外的遗传物质，由共价闭合环状双链DNA分子组成，能独立于细胞核进行自主复制。大小：分子量约为２—100×106D，携带1—100个基因,一个菌细胞可有一至数个质粒。

质粒的特点：可自我复制，稳定遗传。对生存不是必要的。复制与染色体分开，但同步进行。不同质粒携带不同遗传信息。无质粒细菌可通过接合、转化、转导等方式获得，不能自发产生。例：细菌抗药性因子、大肠杆菌的F因子。质粒应用:基因工程，体外重组.三、原核生物的质粒1.特点：①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；②质粒是一种复制子（replicon），依据自我复制实力的不同，可把质粒复制的限制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核限制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1－5）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核限制，在染色体DNA复制停止的状况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10－200个或更多。③可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。④对于细菌的生存并不是必要的⑤功能多样化三、原核生物的质粒2.质粒在基因工程中的应用

质粒在基因工程操作中的优点：1.体积小，便于DNA的分别和操作；2.呈环状，在化学分别过程中能保持稳定性；3.有不受核基因组限制的独立复制起始点；4.拷贝数多，使外源DNA可快速扩增；5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。E.Coli

的PBR322质粒E.Coli的PBR322质粒的具体优点：1.体积小，仅4361bp；2.在宿主E.coli中稳定地维持高拷贝数（20－30个/细胞）；3.氯霉素抑制宿主蛋白质合成，则每个细胞可扩增到含1000－3000个质粒；4.分别极其简洁；5.可插入较多的外源DNA（不超过10bp）；6.结构完全清晰，各种核酸内切酶可酶解的位点可随意选用；7.有两个选择性抗药标记（氨苄青霉素和四环素）；8.可便利地通过转化作用导入宿主细胞。功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis、根癌土壤杆菌等制备：包括增殖、裂解细胞、分别质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜视察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法3.质粒的分别与鉴定1.细菌的培育和收集

将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培育基(含50μg/mlAmp)中,37℃培育12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培育基(含50μg/mlAmp)中,37℃振荡培育约12小时至对数生长后期。

2.溶菌：一般用溶菌酶去壁形成原生质球或原生质体3.碱变性处理：在SDS等表面活性剂存在下加NaOH溶液使pH升至12.4可使菌体蛋白和染色体DNA均不行逆变性而与质粒DNA分开。4.离心分别：经高速离心可以使细胞碎片和已变性的菌体蛋白和染色体DNA一道沉淀，上清液主要是质粒DNA，经乙醇沉淀后，可获得质粒DNA。1.琼脂糖凝胶电泳DNA电泳速率排列：超螺旋、共价、闭合环状DNA(cccDNA)>缺刻环状DNA(ocDNA)>线性DNA(LDNA)2.氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心3.电镜视察4.质粒的种类：

种类

代表菌1.接合性质粒E.Coli的F质粒；Pseudomonas（假单胞菌属）的pfdm和K质粒；Vibriocholerae（霍乱弧菌）的P质粒；Streptomyces（链霉菌属）的SCP质粒2.抗药性质粒：抗抗生素，抗重金属等离子肠道细菌和Staphylococcus（葡萄球菌属）的R质粒3.产细菌素和抗生素质粒肠道细菌；Clostridium（梭菌属）；Streptomyces4.具生理功能的质粒利用乳糖、蔗糖、尿素、固氮降解辛烷、樟脑、萘、水杨酸产生色素结瘤和共生固氮

肠道细菌

PseudomonasErwinia（欧文氏菌），StaphylococcusaureusRhizobium（根瘤菌属）5.产毒质粒E.Coli，Staphylococcusaureus几种代表性质粒：1.F–因子（fertilityfactor）：又称致育因子或性因子，是E.coli等细菌确定性别并有转移实力的质粒，62×106Da，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，确定性别。Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.

Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.F质粒的遗传结构又称致育因子或性因子，是E.coli等细菌确定性别并有转移实力的质粒，62×106Da，99.15kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。（1）转移区（3）插入区（2）复制区F因子(F-factor)

转

重

移

IS3δ

组

IS3

区

区

OIS2

POriTOriV

复

区

制

最初发觉于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发觉还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性确定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11×106Dalton，限制质粒copy数及复制，抗性确定质粒大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。R-因子在细胞内的copy数可从1~2个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。2.R因子（resistencefactor）

RTF（含转移和复制基因）+IS

R质粒r确定因子（含抗药性基因）产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约4×104－8×104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1分子量约为5×106Dalton，无接合作用，是多copy的；ColE1探讨得很多，并被广泛地用于重组DNA的探讨和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为80×106Dalton，它与F因子相像，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型限制，只有1~2个copy。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其损害。3.Col因子（colicinogenicfactor）即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起很多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏限制细胞分裂的激素调整系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程探讨中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以变更该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。5.Ti质粒（tumorinducingplasmid）4.Ri质粒与Ti质粒相像，存在于发根土壤杆菌或发根农杆菌，其侵染双子叶植物时，可诱发大量称为毛状根的不定根。其中Ri质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞核基因组中，使之发生转化，并在宿主细胞内稳定遗传。是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发觉的一种质粒，分子量为200－300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。6.巨大质粒（mega质粒）降解性质粒只在假单胞菌属中发觉。它们的降解性质粒可为一系列能降解困难物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。7.降解性质粒其次节基因突变和诱变育种突变（mutation）：指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变更。染色体畸变——细胞学上可以看到染色体的变更突变基因突变——细胞学上看不到遗传物质的变更突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（wildtype）：从自然界分别到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株★依表型的变更分为：1.养分缺陷型——因突变而丢失产生某种生物合成酶的实力，并因而成为必需在培育基中添加某种物质才能生长的突变类型。2.抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性3.条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型4.形态突变型——由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。5.抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生变更。6.产量突变型——通过基因突变而产生的代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。7.发酵突变型——丢失产生某种生物合成酶实力的突变型。（一）基因突变的类型★按是否比较简洁、快速地分别到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant）：具有选择标记（如养分缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培育基、温度、pH值等，就比较简洁检出和分别到。非选择性突变株（non-selectivemutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10–8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10–8。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。由于突变的几率一般都极低，因此，必需接受检出选择性突变株的手段，尤其是接受检出养分缺陷型的回复突变株（backmutant或reversemutant）或抗性突变株特殊是抗药性突变株的方法来加以确定。（二）突变率若干细菌某一性状的自发突变率

菌名突变性状突变率E.Coli

抗T1噬菌体3×10–8E.Coli

抗T3噬菌体1×10–7E.Coli

不发酵乳糖1×10–10E.Coli

抗紫外线1×10–5Staphylococcusaureus抗青霉素1×10–7S.Aureus

抗链霉素1×10–9

Salmonellatyphi

抗25g/L链霉素1×10–6

Bacillusmegaterium

抗异烟肼5×10–

5（三）突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变缘由之间无干脆的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会相互影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突 变（forwardmutation），从突变株回到野生型的 过程则称为回复突变或回变（backmutation或 reversemutation）。（四）基因突变的自发性和不对应性的证明在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的缘由争论特别激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的反抗对象）诱发出来的，突变的缘由和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。从1943年起，经过几个严密而奇妙的试验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，最终解决了这场纷争。变量试验又称波动试验或彷徨试验。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück依据统计学原理，设计了左方的试验。1.变量试验fluctuationtest2.涂布试验

原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。涂布试验中突变率的计算初始接种量：5×104个/皿培育5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：5100×5×104≈2.6×108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为： 6×（2.6×1085×104）=15.6×108在未涂布的平板上共发觉28个突变，故突变率=28/15.6×108=1.8×1083.平板影印培育试验（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫妇的论文《平板影印培育法和细菌突变株的间接选择》，更好地证明白微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。平板影印培育法，是一种能达到在一系列培育皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培育方法：把长有很多菌落的母种培育皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培育基平板上。待这些平板培育后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上10-20%量的细菌转移到丝绒布上，并可利用这一“印章”接种8个子培育皿。因此，通过影印培育法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分别出各种类型的突变株。平板影印培育法在根本未接触过任何一点链霉素的状况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明白突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。平板影印培育不仅在微生物遗传理论的探讨中有重要应用，而且在育种时间和其它探讨中均有应用，值得很好地领悟。（五）基因突变的机制基因突变的缘由是多种多样的，可以是自发的或诱发的，诱变又可分为点突变和畸变。具体类型可归纳如下：1.诱变机制诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。依据遗传物质结构变更的特点探讨几种有代表性的诱变剂的作用机制。（1）碱基置换（substitution）定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（pointmutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。依据化学诱变剂是干脆还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来探讨。碱基置换突变

一个碱基被另一碱基取代而造成的突变称为碱基置换突变转换（transition）

颠换（transversion）

：嘌呤→嘌呤，嘧啶→嘧啶：嘌呤→嘧啶，嘧啶→嘌呤TGCA类型突变的效应

1、同义突变（same-senseorsynonymoumutation）:碱基的变更并未引起编码的氨基酸变更。例如，CCA→脯氨酸，当A→G后，CCG→脯氨酸。2、错义突变（missensemutation）:碱基的变更引起编码的氨基酸变更。例如，GAG→谷氨酸，A→T，GUG→缬氨酸。3、无义突变（non-sensemutation）:碱基的变更使该三联体不再构成任何氨基酸的密码子，而形成终止信号。例如：TAC→酪氨酸，C→A，TAA→mRNA→UAA→终止信号。★干脆引起置换的诱变剂定义：一类可干脆与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。种类：很多。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。羟胺只引起G┇C→A:T，其余都是可使G┇C=A:T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有（参见下表）。若干诱变剂的作用机制及诱变功能诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟胺 与胞嘧啶起反应 GC→AT的转换亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换交联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换 烷化磷酸基团 AT→TA的颠换 丢失烷化的嘌呤 GC→CG的颠换 糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（＋或－） 紫外线 形成嘧啶的水合物 GC→AT转换 形成嘧啶的二聚体码组移动（＋或－） 交联 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换DNA降解 码组移动（＋或－） 糖-磷酸骨架的断裂巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丢失嘌呤

加热 C脱氨基 CG→TA转换Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动 亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黄嘌呤（H）HNO2鸟嘌呤（G）黄嘌呤（X）这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。碱基转换的分子机制——以亚硝酸为例

腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程：①腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He）②He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）③DNA复制时，HK与胞嘧啶（C）配对④DNA其次次复制时，C与G正常配对，实现了转换。亚硝酸引起的AT-GC转换细微环节这类诱变剂主要是一些碱基类似物

,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等等；

作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例：

5-BU是胸腺嘧啶（T）的的类似物，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。★间接引起置换的诱变剂5-BU引起的转换5-BU引起的转换从上图中，还可以看到5-BU的掺入引起的G┇C回复到A׃T的过程。通过这两个图示，就很简洁理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的缘由了。也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。（2）移码突变frame-shiftmutation或phase-shiftmutation，指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shiftmutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。图8-14——能诱发移码突变的几种代表性化合物引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤—嘧啶对特别相像。丫啶类化合物的诱变机制：至今还不很清晰。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤–嘧啶对特别相像，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增加或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：（3）染色体畸变（chromosomalaberration）某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）——染色体畸变，它包括：染色体结构上的变更：缺失（deletion）重复（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色体数目的变更★染色体结构上的变更分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变更，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的削减或增加；如发生倒位或易位时，则可造成基因排列依次的变更，但数目却不变更。倒位--------是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因依次与其它的基因依次相反；易位--------是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。染色体畸变转座因子（transposibleelement）由40年头B.McClintock对的遗传探讨而发觉染色体易位，自1967年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证明，并已成为分子遗传学探讨中的一个热点。旧概念：基因是固定在染色体DNA上的一些不行移动的核苷酸片段。新发觉：有些DNA片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA依次的跳动过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。转座因子（transposibleelement）：在染色体组中或染色体组间能变更自身位置的一段DNA依次。也称作跳动基因（jumpinggene）或可移动基因（movablegene）。转座因子的种类（1）插入序列（IS，insertionsequence）：特点是分子量最小（仅0.7－1.4kb），只能引起转座（transposition）效应而不含其它基因。可以在染色体、F因子等质粒上发觉它们。已知的IS有5种，即IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E.coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使F因子插入到E.coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其缘由可能是IS被切离，假如因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。转座因子的种类（2）转座子（Tn，transposon，又称转位子，易位子）：IS和Mu噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为2－25kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。Tn虽能插到受体DNA分子的很多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。转座因子的种类（3）Mu噬菌体（即mutatorphage，诱变噬菌体）：它是E.coli的一种温顺噬菌体。与必需整合到宿主染色体特定位置上的一般温顺噬菌体不同，Mu噬菌体并没有确定的整合位置。与以上的IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是养分缺陷型突变。2.自发突变机制自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。几种自发突变的可能机制★微生物自身有害代谢产物的诱变效应：过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。它对Neurospora（脉孢菌）有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，假如在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢很可能是“自发突变”中一种内源性诱变剂。在很多微生物的陈旧培育物中易出现自发突变株，可能也是同样的缘由。★互变异构效应：碱基T、G的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现C、A的第六位上是氨基，会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现平衡一般趋向于酮式或氨基式，在DNA双链结构中一般总是以A︰T和G┇C碱基配对的形式出现在偶然状况下，在DNA复制到达这一位置的瞬间，在T以稀有的烯醇式出现时，其相对位置上就出现G同样，假如C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位置的瞬间，则在新合成DNA单链中与C相对应的位置上就将是A。这可能就是发生相应的自发突变的缘由。要预言在某一时间、某一基因发生自发突变是不行能的。在运用数学方法对这些偶然事务做大量统计分析后，可以发觉并驾驭其中的规律。例如，据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10–8-10–9。★环出效应：即环状突出效应。有人提出，在DNA的复制过程中，假如其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。下图就是环出效应的设想机制。在上链中，标记B处发生“环出”，故只有A及C能获得复制，从而发生自发突变。而在下链中，复制仍正常进行（六）紫外线对DNA的损伤及其修复已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。发觉较早和探讨得较深化的是紫外线（U.V.，ultravioletray）的作用。嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清晰的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消退。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会阻碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。光复活作用（photoreactivation）定义：经紫外线照射后的微生物马上暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。这一现象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomycesgriseus（灰色链霉菌）中发觉的。后来，在很多微生物中都得到了证明。最明显的是在E.coli的试验中：比照：8×106个/mlE.coliU.V. 100个/mlE.coli试验：8×106个/mlE.coliU.V.360~490nm2×106个/mlE.coli可见光，30分经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（photoreactivatingenzyme）即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300~500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。每一E.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。图:光复活作用暗修复作用（darkrepair）又称切除修复（excisionrepair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和γ射线等）损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。有四种酶参与——①内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5’一侧切开一个3’-OH和5’-P的单链缺口；②外切核酸酶从5’-P至3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；④通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端与原链的5’-P末端相连接，从而完成了修复作用。暗修复作用（darkrepair）1、由核酸内切酶切开二聚体的5’末端，形成3’-OH和5’-P的单链缺口2、核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3’-OH与原有的5’-P相连接。紫外诱变方法:设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，紫外灯：波长为253、7nm,功率是15W处理时的照射距离：20cm—30cm样品：要干脆暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm照射时，要用磁力搅拌器搅拌。处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时辰表示照射剂量并不完全牢靠。确定的死亡率必定对应确定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更牢靠。通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适的剂量。生产上常常接受的剂量：死亡率为70%——80%左右。重组修复：必需在DNA复制的状况下进行，所以又叫复制后修复。细胞在不切除二聚体的状况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体旁边留有一空隙。通过染色体交换，空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，DNA聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复，重组修复中的DNA损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，损伤的比例渐渐降低。诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生变更，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。是用物理或化学的诱变使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生变更，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所运用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。（七）诱变育种（一）自发突变与育种1.从生产中选育刚好选择出正变菌株如：宇佐美曲霉3758号菌株2.定向培育优良菌株定向培育：利用微生物的自发突变，并接受特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良的古老方法。如：卡介苗（BCGvaccine）

（二）诱变育种的步骤：原始菌种纯化斜面/肉汤培育单孢子/单细胞悬液诱变剂处理平板分别移至斜面小试中试初筛复筛计算存活率视察形态变异，挑单菌落良种保藏原菌种特性鉴定诱变育种的基本过程：选择选择合适的动身菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验诱变育种中的几个原则：(1)选择简便有效的诱变剂(2)选择优良的动身菌株(3)处理单细胞或单孢子悬液(4)选用最适的诱变剂量(5)充分利用复合诱变的协同效应(6)利用和创建形态、生理与产量间的相关指标(7)设计高效的筛选方案(8)创建新型筛选方法1.动身菌株的选择：

动身菌株———用来育种处理的起始菌株

◆动身菌株应具备：

①对诱变剂的敏感性高；

②具有特定生产性状的实力或潜力；

◆动身菌株的来源；

①自然界干脆分别到的野生型菌株：

②历经生产考验的菌株：

③已经验多次育种处理的菌株：2.制备细胞悬液

要求：

①菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；

②细胞分散且为单细胞，以避开表型拖延现象（phenotypiclag）;

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐温80（表面活性剂）

③用无菌脱脂棉过滤。

制备：

物理诱变剂——生理盐水（0.85%NaCl)

化学诱变剂——缓冲液

浓度：

细菌、放线菌108个/ml

霉菌、酵母菌106个/ml表型拖延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。产生缘由：①分别性拖延现象②生理性拖延现象3.诱变处理：诱变剂的作用：①提高突变的频率②扩大产量变异的幅度③使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70-80%）选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最便利的因素；而在同样便利的状况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最便利，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为便利。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上动身菌株细胞，然后在平板上匀整地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培育后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出很多单菌落，最终可用影印培育法或逐个检出法选出突变种。★缺陷型的应用作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、探讨代谢过程时用作亲本标记；作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；作为aa、维生素、碱基的测定菌株。Amestest：对化学诱变剂做检测菌种：鼠伤寒沙门氏菌his-；原理：his-在基本培育基上不长；而发生回复突变则长。Amestest方法示意图诱变处理方式：

单一因子处理：复合因子处理：两种以上因素协同效应先后使用同时使用单一因子重复使用实行土壤样品要考虑的几个问题土质肥，微生物含量高，特殊肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。离地面5－20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，喊菌量最高。采土季节以春秋两季最好。采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被状况等。多点采土、混合分别，可以代表每一地块上的微生物分布平均状况4.菌种筛选土样的富集培育含有目的菌较多的土样不须要富集培育假如原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培育使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分别。富集培育的一般方法：接受有利于目的菌种而不利于无关微生物的养分和培育条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。一些有特定物质产生实力的菌种，不简洁富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。某些细菌的富集条件富集对象 接种菌样添加养分物(g) 特殊培育条件好氧氨基酸氧化菌 土壤 – 好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌 土壤，巴氏消毒 – 好氧，pH7.0氨基酸发酵性梭菌 土壤，巴氏消毒 – 厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6厌氧八叠球菌 土壤 葡萄糖20 厌氧，pH2~3乳酸菌 植物体或牛奶 葡萄糖20 厌氧，pH6.5肠道细菌 土壤或污水 葡萄糖20，CaCO320 好氧或厌氧，pH7.0丙酸菌 干酪 乳酸钠20 厌氧，pH7.0醋酸菌 果实或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培育基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培育在30℃下。1.“投其所好”或抑制选择2.选择性理化因素温度、氧、pH和渗透压等。纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉5gNaNO31gNa2HPO4·7H2O0.5gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5gKCl0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml大肠菌群：是指37℃生长时能发酵乳糖,在24h内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌,除包括大肠埃希氏杆菌属外,还包括肠杆菌科的肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属。4.1筛选方案：实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；——因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简洁。复筛的目的：确认符合要求的菌株；——复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.可见，设计和接受效率高的筛选方案和方法极其重要。以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：第一轮：一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株→→→选出5株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：5个出发菌株→→→→→→选出50株→→→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）诱变处理4.2变异菌的一般筛选方法4.2.1平皿快速检测法变色圈法透亮圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法4.2.2摇瓶培育法用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株羧甲基纤维素钠作培育物抗生素筛选检定菌培育，加上发酵液以温度敏感突变为例：筛选方法：用途：常用于提高代谢物产量缘由：是由于某一酶蛋白结构变更后，在高温下活力丢失重要性：假如此酶为蛋白质、核酸合成途径中所需的酶，则此变异株在高温下的表型就是养分缺陷型。4.3.1条件抗性突变型的筛选4.3特殊变异菌的筛选方法：举例：由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88:30℃培育时能正常生长40℃是死亡，但能在富含生物素的培育基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。在富含生物素的培育基中进行发酵时：先在30℃（允许条件）中进行培育以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（40℃，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。方法：梯度平板法（gradientplate）4.3.2抗药性突变株的筛选抗药性突变株的应用：作为菌株的遗传标记作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）4.3.3抗生素抗性变异株的筛选：★与养分缺陷突变有关的三类遗传型个体：养分缺陷型：经诱变产生的一些合成实力出现缺陷，而必需在培育基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-，bio-野生型：自然界分别到的任何微生物，在其发生养分缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。如：lys+;bio+;原养型：指养分缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。4.3.4养分缺陷型(auxotroph)的筛选★与筛选养分缺陷型突变株有关的三类培育基基本培育基（MM）[-]：凡是能满足野生型菌株养分要求的最低成分的合成培育基。完全培育基（CM）[+]：满足一切养分缺陷型菌株生长的自然或半合成培育基。补充培育基（SM）[x]：在MM中有针对性地加入一或几种养分成分以满足相应养分缺陷型菌株生长的合成培育基。★养分缺陷型诱变筛选步骤及方法auxo的鉴定

诱变处理auxo的浓缩auxo的检出缺陷型的浓缩：①抗生素法原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：将菌培育在含抗生素的MM基中②菌丝过滤法适用于：丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培育基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。①逐个检出法：缺陷型的检出：②影印平板培育法③夹层培育法①生长谱法方法简便；回变和污染不影响结果测定物质可为粉末或纸片

缺陷型的鉴定：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；其次节段：依据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；组合养分物法：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a.将多种养分因子编组；b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培育基上培育；c.结果分析；如：一组：1

2345

二组：26

789

三组：3710

1112

四组：48111314

五组：59121415养分因子分组编排时留意；1）每组内无重复的营养因子2）每组中应包含只出现一次的因子3）每组中其他因子应分别出现二次

一组：1

2345

二组：26

789

三组：3710

1112

四组：4811

1314

五组：59121415②组合补充培养基法：将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷类型，或快速分离出所需缺陷类型的菌株。ABFEDCHG第三节基因重组定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）或遗传重组。作用：重组可使生物体在未发生突变的状况下，也能产生新遗传型的个体。重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必定包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexualhybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。微生物中各种形式基因重组的比较 重组范围 整套染色体 局部杂合供体和受体的关系 高频率 低频率部分染色体个别或少数基因细胞融合 性细胞真菌的有性生殖 或联结 体细胞 真菌的准性生殖 细胞间短暂沟通 细菌的接合 性导 细胞间 吸取游离DNA片段 转化不接触 噬菌体携带DNA 转导噬菌体 完整噬菌体 溶源转变供应遗 噬菌体DNA 转染 传物质基因重组的意义基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：①由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。②利用杂交育种往往还可以消退某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较困难，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和运用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年头后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。

甲

生长快、产量低乙生长慢、产量高基因重组如：生长快、产量高一、原核微生物的基因重组基因重组的方式转化（吸取游离DNA片段）转导（噬菌体携带DNA）接合（细胞间短暂沟通）原生质体融合（人工细胞融合）ConjugationTransformationTransduction定义：受体菌自然或在人工技术作用下干脆摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。有关名词：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者供体菌：donor，转化基因的供应者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子（一）转化（transformation）1、转化及其发觉：R型活菌+S型死菌→→S型活菌1.转化供体菌裂解游离的DNA片段被受体菌干脆摄取，使受体菌获得新的性状①受体细胞要处于感受态.感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态②供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1×107D左右③菌株间的亲缘关系亲密2、转化发生的条件：3、转化的类型：依据感受态建立的方式，可以分为：①自然遗传转化naturalgenetictransformation②人工转化artificialtransformation

感受态：出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。Streptococcuspneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。感受态由细胞