药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析

药品分析方法学验证中各项指标深度剖析药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析1/32一、线性试验主成份含量测定以测定浓度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。

溶出（释放）度测定以释放量10%～120%间选取5个点即可。

杂质含量用杂质对照品准确测定以杂质程度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析2/32测定结果：

1）阐述怎样对待截距和斜率、怎样应用。

2）误差在哪里，应用时注意事项。

3）为何没有不成线性？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。

个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。

4）都成线性、为何还要做？最小二乘法原理知晓。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析3/32唑来磷酸结构式药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析4/32引申使用：

1）相关物质测定归一化法和本身对照法相互妙用。

2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。

3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度靠近到何等程度了解。

4）国内只重视相关系数，不重视截距。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析5/32二、精密度试验重复性试验：连续进样6次。

中间精密度试验和重现性试验经过“耐用性试验中溶液稳定性试验”来表达。

浓度极低时才会不理想，加大进样量。

色谱峰形极为主要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相百分比，使被测物质峰尽快出峰。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析6/32三、准确度试验用回收率来衡量作法：在80%~120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定。

已知杂质、且有杂质对照品，可采取加入法，即加样回收率来评价。

普通情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好！药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析7/32四、专属性相关物质为主，其它检测项目（含量）基本上均参考相关物质。

相关物质验证，采取中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成份分离。

药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析8/32系统适用性试验配制方法：

在100％浓度主成份溶液中加入1%浓度杂质对照品，以模拟样品中有可能存在状态。

介绍配制方法——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓对照品溶液）来稀释，简便、易行！药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析9/32专属性试验验证图谱药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析10/32存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成份峰骤然加大，将杂质峰覆盖。

强破坏试验目标：

验证药品在遭遇了极端气候环境条件下产生杂质，在所建立色谱条件下是否能够分离、测定。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析11/32●检测波长确实定

包括到各被检测物质在该波长下响应因子是否相同，即所谓重量校正因子问题。（f=A杂质/A被测成份）

选取主成份与各杂质含有相同紫外吸收波长（f=1.0）。

选取各杂质紫外吸收大于主成份紫外吸收波长（f>1.0），这么可愈加严格控制杂质程度。

如选取各杂质紫外吸收小于主成份紫外吸收波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），不然将得到错误判断。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析12/32介绍该项检测由来和历史背景

要看主峰里是否有杂质，怎样判断？但需注意DAD检测器不足，介绍“土方法”！

结果：当前从来没有推翻现行色谱条件。意义在哪里。怎样应用，拿到只是“走形式”？药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析13/32最小峰面积设定

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其设定，不是绝对值，而是相对值。

●英国药典中有明确说明：凡相关物质检测采取HPLC法测定时，均要求舍弃对照溶液主峰面积几分之几峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度0.1%~0.05%）。如要求杂质程度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考评时，可设定到0.01%最小峰面积。

●原料药销售与购置协议中，为确保双方达成一致意见，此点应给予重视。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析14/32强力破坏试验

●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。

●氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。

●高温破坏取原料适量，依据各自品种熔点不一样，在高温下破坏至外观性状改变

●强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析15/32四、检测限●

信噪比三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。

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是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度多少分之一而言，普通最少要在5000倍以上。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析16/32相关物质、含量与本身对照三者浓度关系药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析17/32积分参数设定●积分参数设定是非常主要。由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。●采取本身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。●供试品溶液最小峰面积设定将直接造成测定结果。设定得太小，会造成很多小峰甚至是基线漂移小峰均被积分出作为杂质峰，从而造成杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反应不出杂质情况。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析18/32方法学认证中耐受性试验

是指更换试验原因，如不一样人员、不一样仪器，不一样色谱柱型号、厂家，不一样试剂等原因。这一点才是真正至关主要！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析19/32方法学认证中溶液稳定性全方面判定不能单从主成份入手！还要注意全部组分百分比改变，绝对值改变！药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析20/32杂质-1（为已知杂质）青蒿琥酯杂质-2杂质-3新杂质时间(h)峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比均未检出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.16%591850.56%4500020.42%RSD0.96％药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析21/32流速、柱温与溶剂选择●在测定时通常调整流速使主成份保留时间稍长些，且使主成份峰不拖尾即可。●柱温对分离效果影响虽有一定影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超出35℃。●溶剂选择应测定样品溶液在该溶剂中稳定性来衡量，尽可能勿选择挥发性强溶剂；同时应确保对照溶液主成份峰面积精密度良好。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析22/32质量标准中制订相关物质标准●采取杂质对照品法、用于降解产物准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。●采取强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中氧氟沙星全部品种，均在HPLC法色谱条件下确定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生紧邻主峰前杂质峰与主峰分离度应符合要求。●不采取任何方式。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析23/32经典强破坏试验图谱药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析24/32药品含量测定方法设计——原料药原料药:对于组份单一原料药,首选容量法测定含量强调：（1）供试品取用量应满足滴定精度要求（消耗滴定液约20ml）；（2）滴定终点判断要明确，如选取指示剂法，应考虑其变色敏锐，提供滴定曲线，并用电位法校准其终点颜色。（3）为排除因加入其它试剂或混入杂质对测定结果影响，或便于剩下滴定法计算，可采取“将滴定结果用空白试验校正”方法；（4）最终要给出滴定度（采取四位有效数字）。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析25/32容量法测定含量要注意参加反应应是药品分子活性部分，而不应是次要酸根或碱基部分。如盐酸氨溴索，有研究者采取氢氧化钠滴定液测定其含量，实际上这种方法测定是其中盐酸含量，因为其成盐工艺中酸、碱配比不妥时，可严重影响成品酸碱度，故测定结果并不能代表其活性成份有机碱含量。应采取非水滴定法，以无水冰醋酸为溶剂屏蔽掉盐酸干扰，用高氯酸滴定其有机碱含量。高氯酸非水滴定法因适应性广（适合用于有机弱碱及其盐类）在化学原料药含量测定中较为惯用。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析26/32如用容量法不宜时，可考虑选取HPLC法，尤其在相关物质干扰，或多组份物质时，含有特殊优势。普通不选取UV法，尤其不首选“吸收系数法”定量，不选取末端吸收峰作测定波长；须用UV法时，可采取不受仪器及其它改变影响“对照品比较法”定量，测定溶液吸收度宜在0.3～0.7间。元素测定法如定氮法，在其它方法均不宜时可采取，但因不能反应化合物含量改变情况，此法不可用于稳定性考查中。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析27/32药品含量测定方法设计——制剂应考虑辅料等干扰，首选方法普通为HPLC法，在相关物质、辅料不干扰情况下，也可选取UV法或原料药项下容量法。复方制剂首选HPLC法。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析28/32药品含量测定方法设计——验证订入质量标准含量测定法不一样于普通质量考查方法，须经过严格方法学验证。容量分析法验证：①精密度：用原料药精制品（含量>99.5%）考查方法精密度，平行试验5个样本RSD≤0.2%；②准确度：以测定原料精制品回收率计算，应在99.7%～100.3%之间（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定终点确定依据：包含滴定曲线绘制，如用指示剂法确定终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂颜色与电位改变情况对比结果；药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析29/32④耐用性：考查测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。HPLC法验证：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②准确度：用于制剂时，要考查辅料影响，将一定量药品加到按处方百分比配制辅料中（为标示量80%～120%）制成高、中、低三个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品，按确定方法测定回收率，应在98%～102%之间（n＝9,RSD≤2%）。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析30/32③线性范围：用已知含量精制品配制一系列浓度溶液（n＝5～7），用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物响应值之比进行回归处理，线性方程相关系数r≥0.9990，截距越小越好，并提供线性关系图；④专属性：辅料、相关物质或降解产物峰对主药峰应无干扰；⑤耐用性：考查测定条件（供试液稳定性、流动相组成和pH值、不一样品牌或批号同类色谱柱、柱温、流速、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明；⑥灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求。药物分析方法学验证中各项指标的深度剖析31/32UV法验证：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②准确度：方法同HPLC法，回收率应在98