生物化学与分子生物学八课件25市公开课金奖市赛课一等奖课件

重组DNA技术RecombinantDNATechnology第二十四章第1页第1页克隆(clone)来自同一始祖相同副本或拷贝集合。获取同一拷贝过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecularclone)

即DNA克隆(DNAcloning)细胞克隆器官（或组织）克隆个体克隆（动物或植物）第2页第2页重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）又称分子克隆（molecularcloning）或DNA克隆（DNAcloning）或基因克隆（genecloning)技术，是指在体外利用酶学办法将目的DNA片段与能自主复制遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而取得单一DNA分子大量拷贝。

克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用办法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术。第3页第3页*重组DNA技术发展简史1865年G.J.Mendel豌豆杂交试验1944年O.T.Avery肺炎球菌转化试验1972年P.

Berg构建第一个重组DNA分子(猿猴病毒DNA和

λ噬菌体DNA)1973年S.Cohen初次将DNA片段与质粒连接，并转化入E.coli1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工，程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上主要药物1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素工厂1997年英国罗林研究所成功地克隆了“多莉”羊MendelPaulBergIanWilmutand“Dolly”第4页第4页第一节

重组DNA技术中惯用工具酶

FrequentlyUsedEnzymesinRecombinantDNATechnology

第5页第5页限制性核酸内切酶DNA连接酶碱性磷酸酶反转录酶末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶I大片段

TaqDNA聚合酶多核苷酸激酶

工具酶在重组DNA技术中含有特殊用途

第6页第6页重组DNA技术中惯用工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶辨认特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接碱性磷酸酶切除末端磷酸基反转录酶合成cDNA；替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析末端脱氧核苷酰转移酶

在3´羟基末端进行同聚物加尾DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；DNA序列分析；填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标识等TaqDNA聚合酶

惯用于PCR；产物3′末端带有A，可用于T-A克隆多核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标识探针第7页第7页一、限制性核酸内切酶用于切割DNA定义:限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是辨认DNA特异序列,并在辨认位点或其周围切割双链DNA一类内切酶。限制性核酸内切酶是重组DNA技术中主要工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第8页第8页分类：依据酶识别切割特性、催化条件及是否含有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类（基因工程技术中惯用Ⅱ型）★Ⅰ型：属于复合功效酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作为催化辅因子，在DNA降解时伴随有ATP水解。即它含有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。若识别位点上两条DNA链均未甲基化，则行使内切酶功效，并在切割DNA同时或之后转变为ATP酶；若位点上只有1条链被甲基化则发挥修饰功效，使另一条链也甲基化；若位点上两条链均甲基化就与位点解离。其显著特点是识别位点和切割部位不一致，无固定切割位点，普通在识别位点以外1kb（不少于400bp）到几kb（可多达7kb）处随机切割，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。★Ⅲ型：与Ⅰ型酶特性类似，也有甲基化功效，但无ATP酶和DNA解旋酶活力；不同是它能在DNA链上特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程意义也不大。第9页第9页限制酶作用与甲基化酶共同构成细菌限制修饰系统，限制外源DNA，保护本身DNA，犹似高等动物免疫系统。★Ⅱ型：就是通常指DNA限制性内切酶，在基因工程技术中惯用。特点：分子量小，仅需Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能辨认双链DNA特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异DNA片段。

Ⅱ类酶辨认序列特点为回文结构，普通为4~6bps（有些为8或8个以上碱基序列）

，且富含GC。GGATCCCCTAGG第10页第10页第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写斜体；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；用罗马数字表示发觉先后顺序。命名Hin

dⅢ

属

种

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株第三种酶（一）重组DNA技术中通常使用Ⅱ型限制酶

第11页第11页E=Escherichia，埃希氏菌属co=coli，大肠杆菌菌种R=RY13，菌株名I=第一个被分离到内切酶命名EcoRⅠ

属

种

株序第12页第12页（二）Ⅱ型限制性内切酶含有一些共性和特性1.含有特定辨认和切割位点

限制性内切酶辨认位点限制性内切酶辨认位点ApaIGGGCC’CC’CCGGGSmaICCC’GGGGGG’CCCBamHIG’GATCCCCTAG’GSau3AIGATC’’CTAGPstICTGCA’GG’ACGTCNotIGC’GGCCGCCGCCGG’CGEcoRIG’AATTCCTTAA’GSfiIGGCCNNNN’NGGCCCCGGN’NNNNCCGGII型限制性内切酶辨认位点举例（'示切割位点）第13页第13页2.辨认核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）

第14页第14页第15页第15页BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口3.切割双链DNA分子后产生黏端或平端（stickyend）（bluntend）第16页第16页第17页第17页同尾酶（isocaudarner）

有些限制性内切酶即使辨认序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同黏端，这样酶彼此互称为同尾酶。这两个相同黏端称为配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA4.不同酶能够产生一样末端第18页第18页GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGGG+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ能识别同一序列（切割位点可同或不同）但起源不同两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。5.不同酶能够识别同一个序列第19页第19页6.切割会受其它原因影响

限制性内切酶通常不能切割在辨认位点内有特异碱基甲基化序列。缓冲液或环境温度也会影响一些酶特异性。比如，EcoRI在正常情况下辨认“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度不小于5%（v/v）或反应温度较低时辨认序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性（staractivity），以EcoRI*表示。第20页第20页二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接DNA连接酶（DNAligase）：催化两个相邻3′-OH和5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成缺口连接起来。连接酶作用机制第21页第21页BamHI第22页第22页

1.大肠杆菌染色体编码DNA连接酶

需NAD+作为辅因子

2.大肠杆菌T4噬菌体DNA编码T4DNA连接酶

需ATP作为辅因子

DNA连接酶起源第23页第23页三、重组DNA技术中还需使用其它惯用工具酶（一）碱性磷酸酶能清除核酸分子末端磷酸基团（二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏性末端

（四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA（五）DNA聚合酶I大片段保留了有用酶活性（六）TaqDNA聚合酶惯用于PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´羟基末端磷酸化第24页第24页

来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphatase，BAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。用于脱去DNA（RNA）5′末端磷酸基团，使5′-P成为5′-OH，该过程称核酸分子脱磷酸作用。（一）碱性磷酸酶能清除核酸分子末端磷酸基团

P5′OH3′OH3′P5′OH5′OH3′OH3′OH5′第25页第25页（二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA反转录酶（reversetranscriptase）反转录酶催化cDNA合成RNARNA5′3′AAAAAAAAAAAATTTTTT5′3′cDNAcDNA随机引物Oligo-dT第26页第26页

5′3′5′5′3′3′

5′3′OHGGGGGdGTP末端转移酶（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏端

第27页第27页大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）是基因工程中惯用DNA聚合酶。其除含有5′→3′聚合酶活性外，尚有3′→5′及5′→3′核酸外切酶活性。因其含有5′→3′核酸外切酶活性而惯用于DNA探针缺口平移法（nicktranslation）标识。（四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA第28页第28页DNA聚合酶I大片段（largefragmentofDNApolymeraseI）为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）裂解后产生大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）。其保留了5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性，失去了5′→3′外切酶活性。它含有3′→5′外切酶活性能确保DNA复制准确性，即把DNA合成过程中错配核苷酸清除，再把正确核苷酸接上去（该活性称为校对活性）。

Klenow片段主要用途有：①补齐双链DNA3′末端，使其转变成平端；或通过补齐3′端而使3′末端标识；②在cDNA克隆中，用于第二股链合成；③用于DNA序列分析。（五）DNA聚合酶I大片段保留了有用酶活性第29页第29页将黏端转变成平端GCTTAA

OH3′5′3′5′GAATTCTTAA5′3′3′5′

对5′-黏端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段，在3′-OH端延伸，可填平末端凹陷并将其转变成平端。DNA聚合酶

EcoRⅠ第30页第30页将黏端转变成平端CTGCAG

5′3′5′CG5′3′3′

对3′黏端片段，应用如T4DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性可切去未配正确序列，将其转变成平端。核酸外切酶

PstⅠ

5′3′第31页第31页（六）TaqDNA聚合酶惯用于PCRTaqDNA聚合酶含有良好聚合活性和热稳定性，惯用于PCR。该酶含有5′→3′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，但没有3′→5′外切酶活性，因而无3′→5′校对活性，故在PCR反应中假如发生碱基错配，该酶没有校正功效。针对此不足，当前研发出各种高保真耐高温DNA聚合酶，大大减少了PCR过程中碱基错配率。另外，TaqDNA聚合酶含有末端转移酶作用，能在所合成DNA链3′末端加上一个单独腺苷酸残基（A）。这样PCR产物可直接与带有3′-T线性化载体（T载体）连接（即T-A克隆）。第32页第32页（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´羟基末端磷酸化

惯用是T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase），该酶含5′多核苷酸激酶和3′磷酸酶活性，能催化ATPγ-位磷酸向DNA和RNA5′-羟基转移。该酶惯用于：①DNA或RNA5′末端标识；②使没有5′-末端磷酸DNA片段磷酸化，以供连接和克隆之用。第33页第33页第二节

目的DNA获取PreparationofInterestedDNA第34页第34页一、化学合成法可直接合成目DNA

要求：已知目的基因核苷酸序列或其产物氨基酸序列应用：普通用于小分子肽类基因合成第35页第35页*化学合成法获取目DNA由已知氨基酸序列推测也许DNA序列色苯丙蛋赖第36页第36页

第一步：构建基因组DNA文库（是指包括某一个生物细胞或组织所有基因组DNA序列随机克隆群体，以DNA片段形式贮存了所有基因组DNA信息）。

第二步：筛选含有目的基因克隆。

二、从基因组DNA文库中获取目DNA第37页第37页组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子转化菌限制性内切酶或机械剪切受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带所有基因组DNA片段集合*从基因组DNA文库获取目基因第38页第38页三、从cDNA文库中获取目的DNA

第一步：构建cDNA文库（包括某一组织细胞在一定条件下所表示所有mRNA经反转录而合成cDNA序列克隆群体，它以cDNA片段形式贮存了所有基因表示信息）。第二步：筛选含有目的cDNA克隆。

第39页第39页cDNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带所有cDNA片段集合第40页第40页基因组DNA文库和cDNA文库构建第41页第41页从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目的DNA策略1.菌落或噬斑原位杂交2.针对表示文库，可用抗原-抗体或配体-受体结合原理（亲和筛选法）筛选第42页第42页*从基因组DNA文库获取目基因菌落原位杂交法等办法，可从文库中筛选含有目的基因噬菌体第43页第43页AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcDNAsynthesisInfectcellscDNAlibrary从cDNA文库获取目基因第44页第44页假如已经知道目的基因序列，就能很以便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中取得目的基因，可不必要通过复杂DNA文库构建过程。PCR是一个高效快速体外DNA聚合程序四、经PCR获取目DNA第45页第45页

PCR体系模板引物耐热DNA聚合酶dNTPs含Mg2+缓冲液第46页第46页

PCR过程变性(Denaturing):经加热使模板DNA从dsDNA变成ssDNA退火(Annealing):引物与模板DNA杂交延伸(Extension):DNA合成第47页第47页ing第48页第48页PCR头三个循环第49页第49页酵母单杂交系统五、通过特异杂交系统获取一些转录因子编码DNAA.无转录因子：汇报基因不表示“诱饵”DNA序列B.有转录因子：汇报基因表示C.有转录因子AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：汇报基因表示转录因子AD转录因子DNA结合蛋白汇报基因汇报基因汇报基因.第50页第50页.

汇报基因

汇报基因酵母双杂交系统B.有互相作用蛋白质，汇报基因表示

启动子A.无互相作用蛋白质，汇报基因不表示“诱饵”“猎物”ADBD

上游激活序列

启动子BD“诱饵”“猎物”AD上游激活序列第51页第51页第三节

重组DNA技术中DNA载体DNAVectorsinRecombinantDNATechnology

第52页第52页载体（vector）是为携带感兴趣外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中无性繁殖或表示故意义蛋白质所采用一些DNA分子

按功效分克隆载体（cloningvector）表示载体（expressionvector）按基本元件起源不同质粒载体噬菌体载体黏粒载体病毒载体人工染色体载体等载体概述第53页第53页克隆载体(cloningvector)为使插入外源DNA序列被扩增而特意设计载体称为克隆载体。表示载体(expressionvector)为使插入外源DNA序列可转录和翻译成多肽链而特意设计载体称为表示载体。第54页第54页一、克隆载体用于外源DNA克隆和无性繁殖（一）克隆载体应具备主要特点至少有一个复制起点（originofreplication,ori）至少有一个选择性标志（selectionmarker）有适宜限制性内切酶单一切点：称为多克隆位点（multiplecloningsites，MCS）应有较高拷贝数。

pBR322质粒图谱

第55页第55页1.质粒

(plasmid)特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有一些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。

（二）惯用克隆载体有各种第56页第56页严紧型质粒:质粒与细菌染色体同时复制，处于严密控制之下，其拷贝数较低。松弛型质粒:质粒复制快于细菌染色体复制（即质粒复制不受严格控制），其拷贝数很高。重组DNA技术中使用质粒通常是松弛型。不同质粒必须兼容才干共存于同一细胞中，这对复合转染（或转化）有参考价值。当前，已经有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，如pUC系列、pGEM系列等。质粒载体通常所能容纳外源DNA长度在10kb以内，外源DNA片段越长，质粒越不稳定。第57页第57页pUC系列质粒图谱第58页第58页λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适合用于cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适合用于基因组DNA克隆）cos位点:λ噬菌体DNA为线性双链分子，两端各有一条由12个碱基构成、彼此完全互补且5′单链突出序列（即粘性末端），称cos位点2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列第59页第59页3.穿梭载体（shuttlevector）人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。第60页第60页表示载体是指用来在宿主细胞中表示外源基因载体依据其宿主细胞不同可分为:原核表示载体（prokaryoticexpressionvector）真核表示载体（eukaryoticexpressionvector）二、表示载体用于外源DNA表示第61页第61页（一）

原核表示载体用于在原核细胞中表示外源基因

从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体普通特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。当前应用最广泛原核表示载体是大肠杆菌表示载体。原核表示载体基本构成下列：R：调整序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列大肠杆菌表示载体第62页第62页Lac启动子（乳糖启动子）

Trp启动子（色氨酸启动子）Tac启动子（乳糖和色氨酸杂合启动子）

PL和PR启动子（λ噬菌体左向和右向启动子）

T7启动子1.启动子是启动外源基因表示必需元件，其能被RNA聚合酶所辨认：当前原核表示载体常使用启动子有下列几种

第63页第63页2.SD序列提供核糖体结合位点

mRNA在细菌中翻译严格依赖于核糖体结合位点（ribosomebindingsite）存在。SD序列（Shine-Dalgarnosequence）位于转录起始位点上游8～13bp处，为富含嘌呤短片段，其能与核糖体30S小亚基中16SrRNA3′端部分序列互补结合。SD序列作为核糖体结合位点，确保了翻译起始复合物形成。第64页第64页3.转录终止序列有助于外源基因高效表示尽管载体中没有转录终止序列，也可表示一些外源蛋白，但表示效果通常不抱负。因此，多数原核表示载体中都带有转录终止序列。转录终止序列长短不一，短只有几十bp，长可达几百bp。转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆外源基因，控制所转录RNA长度，提升RNA稳定性。位于启动子上游转录终止序列可制止其它启动子通读，减少本底；位于多克隆位点下游转录终止序列可预防因外源基因表示而干扰载体稳定性。第65页第65页4.几种常见原核表示载体各有特点依据表示目的蛋白方式，可将原核表示载体分为（1）非融合型表示载体（2）融合型表示载体（3）分泌型表示载体

第66页第66页（1）非融合型表示载体用于表示非融合蛋白非融合蛋白是指不与细菌任何蛋白或多肽融合在一起进行表示蛋白。表示该类蛋白载体称为非融合型表示载体。使用强启动子tac，紧接tac启动子是多克隆位点，目的基因克隆于启动子和SD序列下游。在多克隆位点下游包括一个很强rrnB核糖体RNA转录终止子，其作用是为了稳定载体系统，由于上游强tac启动子控制转录必须由强终止子克制，才不至于干扰与载体本身稳定性相关基因表示。载体其余部分来自pBR322。使用pKK223-3时，应配套使用LacIq宿主菌，在无IPTG诱导时，tac启动子受阻遏，当加入IPTG后，便可去阻遏，从而使外源基因表示。

第67页第67页将一段特殊蛋白质（或短肽）基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表示可形成融合蛋白（fusionprotein）。表示该类蛋白载体称为融合型表示载体，如pGEX系统。pGEX系统包括各种载体，如pGEX-lλT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P等。该系统载体使用强启动子tac，紧接启动子是SD序列及其下游GST基因，然后是多克隆位点。用IPTG可诱导目的基因表示，表示产物与GST融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化。（2）融合型表示载体用于表示融合蛋白第68页第68页该类载体长处是能把在受体细菌内表示外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。在构建该类载体时，除有普通表示载体应有启动子等元件外，还需含有编码信号肽序列（通常置于SD序列下游）。分泌型载体既可用于非融合蛋白表示，也可用于融合蛋白表示。pINⅢ系列载体是较惯用分泌型表示载体，可使所表示蛋白分泌到宿主菌周质腔中。该系列载体以pBR322为基础构建而成，带有大肠杆菌中最强启动子之一，即lpp（脂蛋白基因）启动子，其中编码信号肽序列取自大肠杆菌中分泌蛋白基因ompa（外膜蛋白基因）。

（3）分泌型表示载体用于外源基因分泌表示pINⅢ系列载体有3种，即pINⅢ-ompA1、pINⅢ-ompA2和pINⅢ-ompA3，分别适合用于使用不同密码子框架目标基因插入，克隆位点分别为EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ。第69页第69页（二）真核表示载体用于在真原核细胞中表示外源基因

真核表示载体包括在大肠杆菌中起作用复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。真核表示载体中还含有：①真核表示调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、polyA加尾信号等②真核细胞复制起始序列③真核细胞药物抗性基因第70页第70页OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。注：不是所有真核表示载体都有整合序列真核表示载体基本构成

第71页第71页真核开启子和增强子在不同类型细胞中活性差异很大。一些起源于病毒开启子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列（longterminalrepeats，LTR）、SV40病毒早期基因开启子和增强子、人类巨细胞病毒（CMV）开启子等。这些开启子和增强子组合可在广泛宿主细胞中起作用，故在真核表示载体中被普遍使用。第72页第72页真核表示载体带有polyA加尾信号可确保新转录mRNA能有效地加上polyA。为mRNA加上polyA依赖于mRNA3′末端AAUAAA和其下游GU或U富含区。尽管全长cDNA克隆可能已带有AAUAAA序列和一段polyA，但这些序列仍不足以确保polyA有效形成。因此，载体中必须带有polyA加尾信号。惯用来自SV40polyA加尾信号为237bp，其中同时含有针对早期和晚期转录子切割和polyA加尾信号。两套信号作用方向相反，并分别位于不同DNA链上，对mRNA加工均很有效。第73页第73页酵母表示载体昆虫表示载体哺乳类细胞表示载体依据真核宿主细胞不同，真核表示载体可主要分为：第74页第74页（1）酵母表示载体适于在酵母细胞中表示外源蛋白

依据载体在酵母细胞中复制方式不同，可将酵母载体分为五类，YIp：酵母整合型质粒YRp：酵母复制型质粒YCp：酵母着丝粒型质粒YEp：酵母游离型质粒YLp：酵母线性质粒除YLp外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵母细胞中复制与扩增。第75页第75页依据在转化酵母细胞中复制机制，又可将酵母载体分为两个基本类型：①整合型载体，如YIp包括一个酵母ura3标志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复制元件，其需通过质粒DNA与酵母DNA同源序列重组而整合至酵母基因组中

。②自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞中有自我复制能力而得名，属于这类载体有：YRp、YEp和YCp。

第76页第76页YRp含有酵母自主复制序列，但转化后缺乏有效分离，故在有丝分裂后，质粒在亲代细胞分布极多而在子代细胞较少或丢失，在遗传学方面极不稳定。YEp含有可诱导型启动子、信号肽编码序列（惯用交配因子α序列）和酵母质粒2μm环片段，这类质粒可在染色体外自主复制（约50~100拷贝/细胞），其转化效率高且质粒稳定，因此惯用该类载体在酵母细胞中高效表示外源基因。YCp是由自主复制序列与着丝点序列连接而成，该类载体特性是单拷贝（1～2拷贝/细胞），遗传性极其稳定。着丝点序列存在于酵母细胞每条染色体中，该序列在有丝分裂和减数分裂中能使染色体稳定而准确地复制，这是保持该类载体稳定关键原因。第77页第77页（2）昆虫表示载体可在昆虫细胞中表示真核基因

昆虫表示载体主要有两类：①杆状病毒表示载体。载体启动子为多角体蛋白(polyhedrin)基因启动子，所使用外泌信号序列来自蜜蜂milittin序列，其可在宿主细胞（如Sf9或Sf20）中高水平表示外源蛋白。②果蝇表示载体。载体上启动子有Ac5（果蝇黑素激动蛋白5C基因）启动子和MT（果蝇黑素金属硫蛋白基因）启动子，所使用外泌信号序列为Bip序列，其可连续表示或诱导表示外源蛋白。第78页第78页（3）哺乳类细胞表示载体适宜在哺乳类细胞中

表示真核基因

据载体进入宿主细胞方式分为病毒载体和质粒载体据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体DNA，可将其分为整合型和非整合型载体整合型载体普通是随机整合入染色体，但所携带外源基因表示受插入位点影响，同时还也许会改变宿主细胞生长特性，整合型载体通惯用于外源基因稳定表示；非整合型载体通惯用于外源基因瞬时表示最惯用哺乳类细胞表示载体是病毒载体

第79页第79页一个抱负病毒表示载体，通常应具备下列条件：

①使用安全，对宿主细胞无毒副效应；②能容纳较大外源DNA片段且转染效率高；③所产生病毒效价高；④外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表示⑤病毒靶向性强；⑥外源基因表示含有可控性。然而，遗憾是，到当前为止，还没有任何一个病毒载体能满足以上所有抱负条件。

第80页第80页病毒表示载体由各种病毒DNA衍生而来，其构建时普通都把细菌质粒复制起点放置其中，使病毒载体及其所携带目的DNA能以便地在细菌中繁殖和克隆，然后再转入真核细胞。通过质粒化改建病毒载体通常都包括病毒启动子、包装元件、遗传标识和质粒复制起点等几种部分。第81页第81页当前，惯用病毒表示载体包括下列各种：

①反转录病毒（retrovirus,RV）载体

RV属ssRNA病毒。构建RV载体时，将RVDNA插入pBR322质粒，同时删除RV三个编码基因，保留两端LTR和病毒颗粒包装序列Ψ，再加入供筛选标识基因。5′LTR具启动子和增强子活性并具转录起始信号，3′LTR具转录终止信号。RV载体含有较高整合和表示外源基因能力，广泛用于转基因动物和基因治疗研究，但因其随机整合，其安全性问题需加以考虑。

第82页第82页②慢病毒（lentivirus,LV）载体LV载体是以HIV-1（I型人类免疫缺点病毒）为基础发展起来表示载体；与普通RV载体不同是，它对分裂细胞和非分裂细胞均含有感染能力；该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而取得持久表示；该载体宿主细胞较广，在表示目标蛋白和小干扰RNA方面都有广泛应用。第83页第83页③腺病毒（Adenovirus,AV）载体

AV属线性dsDNA病毒；当前，普遍使用是AV第三代载体，载体中清除了所有AV编码基因，仅保留了5′和3′末端反向重复序列（invertedterminalrepeats，ITR）及病毒包装序列Ψ，病毒载体外壳包装需要辅助病毒提供编码序列；第三代AV载体能容纳较大DNA片段，能较长时间地表示外源基因，其毒性和免疫原性都大大减少。

第84页第84页④腺相关病毒（adenovirus-associatedvirus，AAV）载体AAV属于线性ssDNA病毒。构建AAV载体时，用外源基因及其调整序列取代病毒rep和cap编码区，仅保留两端145bpITRs，负责病毒获救、复制、包装与整合；而辅助质粒则保留所有编码序列而无ITRs。两种质粒间无重复序列，重组AAV复制和壳化所需rep和cap基因，由辅助质粒直接以蛋白表示方式提供，故不会发生野生型病毒序列重组、复制和包装。当AAV载体与辅助质粒共转染辅助病毒（AV）感染细胞时，即能获救、复制并包装成重组AAV颗粒。AAV载体含有能稳定表示外源基因、特异整合至人19号染色体长臂末端、病毒稳定且宿主范围广、不引起免疫反应等长处。第85页第85页⑤痘苗病毒（vacciniavirus，VV）载体VV属dsDNA病毒。构建VV载体时，通常以胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因作为筛选标志。tk序列中插有该病毒早期启动子和下游多克隆位点。含有外源DNA重组VV载体tk基因不表示，当与野生型VV共转染宿主细胞并经tk同源序列重组，便可取得既有外源基因又有tk基因重组VV颗粒，进而导入tk缺点细胞后，可在含有次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷培养基中筛选，只有tk表示细胞才干生长。VV载体含有克隆容量大（可插入25～40kb外源DNA片段）、可插入多个外源基因、病毒宿主细胞广且使用安全等长处。第86页第86页⑥猿猴空泡病毒40（simianvacuolatingvirus40，SV40）载体

SV40基因组为双链环状DNA人工构建SV40载体主要有重组病毒质粒载体和取代型重组病毒载体两种类型，前者是将SV40基因组复制起点序列插入质粒载体中，从而构建成病毒-质粒载体；后者是用外源基因取代病毒基因组中与其大小相称一个片段，从而形成取代型重组病毒载体

第87页第87页⑦单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）载体HSV为线性DNA病毒构建HSV载体时，通常由Ⅰ型HSV基因组改建而成当前，HSV载体主要有两类，一类是即刻早期（immediateearly，IE）基因缺点型载体，通过缺失这些IE基因，减少了毒性，从而使外源基因表示时间延长；另一类是利用该病毒扩增子（amplicons）制备载体，该类载体仅含有HSV复制起点和包装序列以及调整序列。辅助质粒为装配型质粒，其除了缺失包装序列外，包括所有HSV基因组。两种质粒共转染宿主细胞后，产生感染性重组病毒颗粒，其中仅含有HSV基因组序列，所有与毒性相关HSV蛋白均以低水平表示HSV载体含有克隆容量大（可插入长达50kb外源DNA）、外源基因可取得稳定表示、整合入宿主基因组后无致癌危险、病毒宿主范围广且有较高转移效率和效价第88页第88页⑧其它病毒载体

除上述病毒载体外，当前用于构建真核表示载体病毒尚有些人巨细胞病毒、脊髓灰质炎病毒等。另外，尚有些人试图利用乙型肝炎病毒等构建真核表示载体。第89页第89页（一）黏粒兼具质粒和噬菌体DNA特性黏粒（cosmid）：又称粘性质粒或装配型质粒，是由λDNAcos区与质粒重新构建而成杂合双链环状DNA载体。黏粒特点：①含有质粒抗性标识基因及复制起点和多克隆位点，可按质粒方式在宿主菌中进行自主复制；②带有λ噬菌体DNAcos序列，可像λ噬菌体DNA同样进行体外包装；③黏粒本身较小，通常只有几kb，但能容纳高达50kb外源DNA片段；④非重组体黏粒很小，故不能在体外进行包装，因此有助于后续阳性克隆筛选；⑤黏粒因缺乏所有λ基因，不会产生噬斑，但在选择培养基平板上形成菌落，这一点也与质粒载体一致。三、特殊载体含有特定用途黏粒pJB8图谱第90页第90页（二）BAC、PAC和YAC用于大片段DNA克隆细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）基于F质粒构建而成。BAC能容纳高达400kb（普通为50kb～250kb）外源DNA。基于大肠杆菌P1噬菌体载体（E.colibacteriophageP1-basedvector,PAC）与BAC克隆容量相称。酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）载体能携带更大DNA片段，其由酵母线性质粒（YLp）发展而来，含有染色体两个端粒片段，能复制出线性DNA，其克隆容量可高达3Mb（普通为500kb～2Mb）。利用重组线性DNA转化细胞，可建成包括人所有基因组DNA巨型YAC文库。BAC、PAC和YAC使用为人类基因组物理图谱和序列测定提供了强有力工具，大大增进了人类基因组计划完毕。第91页第91页端粒重复序列（telomericrepeat,TEL）着丝粒（centromere,CEN）自主复制序列（autonomouslyreplicationsequences,ARS）BamHⅠ切割后形成微型酵母染色体→EcoRⅠ切割形成染色体两臂→外源DNA插入该切点形成人工酵母染色体→转化入酵母菌→通过复制、分裂，克隆大片段DNA第92页第92页（三）启动子探针型载体用于分离和分析基因启动子启动子探针型载体（即通常所说汇报基因载体）是一个快速分离和鉴定基因启动子工具型载体包括两个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元包括质粒克隆载体必备转化系统（复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化细胞）；检测单元则包括一个已失去转录功效且易于检测遗传标志基因以及多克隆位点。比如，pGL3-basic就是一个典型启动子探针型载体，它不含启动子，含有一个荧光素酶（luciferase，luc）标志基因。假如插入片段中含有启动子序列，则luc表示，不然，luc不表示，故依据luc表示是否和表示水平高下，即可判断插入片段中启动子序列有无和活性强弱。

启动子探针型载体pGL3-basic图谱第93页第93页在启动子探针型载体基础上，还发展出了用于分离和分析其它基因表示调控元件（如增强子或衰减子）载体。这类载体与启动子探针型载体区别，就是本身含有启动子，故将空载体转入细胞，就有标识基因（如luc）表示。当在启动子上游或下游（乃至标识基因下游）插入外源DNA片段后，便可依据标识基因表示水平改变来判断所插入DNA片段中是否含有增强或克制基因表示调控元件。第94页第94页（四）组织特异性表示载体使外源基因在特定组织表示把某种组织特异性调控序列（如启动子）构建于表示载体，使外源基因表示严格受控于该调控序列，就形成了组织特异性表示载体该类载体为研究特定组织发育和针对特定组织或器官基因治疗提供了有效手段当前研究较多有乳腺组织特异性表示载体，它是基因工程药物生物反应器；肿瘤细胞特异性表示载体能在肿瘤细胞内有效表示毒性蛋白，从而特异性杀伤肿瘤细胞；神经组织特异性表示载体，对治疗早老性痴呆含有积极作用第95页第95页（五）双启动子和串联启动子表示载体各有特殊用途普通表示载体只有一个开启子，为了特殊需要，可给表示载体组装两个开启子，组成双开启子表示载体，意在方便地研究不同条件下基因表示情况或分别开启不同基因表示。有时为了提升目标基因表示水平，可将两个或两个以上相同开启子串联在一起，组成串联开启子表示载体。第96页第96页（六）一些表示载体用于表示非蛋白分子有些表示载体不用于表示蛋白质，而是用于表示小分子干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或微小RNA（microRNA，miRNA）等。比如，当前，用于表示siRNA载体已有各种（如pSilencer2.1-U6neo，mU6pro等）。

第97页第97页四、载体上惯用标志或标签载体上标志（marker）：通惯用于重组子或阳性克隆筛选、鉴定常见标志有：①抗生素抗性基因

a.用于细菌重组子筛选抗生素抗性基因

b.用于哺乳类细胞阳性克隆筛选抗生素抗性基因②酶编码基因③营养缺点选择标志第98页第98页标签（tag）：其编码序列通常构建于表示载体，与目的基因位于同一阅读框内，这样就可使所表示蛋白上带上标签肽。标签肽大小不等，小只有几种氨基酸残基，大有几十kD。标签肽惯用于表示产物分离、纯化与鉴定。惯用tag序列包括

His：6～8个组氨酸FLAG：八肽序列

Strep：链亲和素，八肽序列HA：血凝素，九肽序列

Myc：十肽序列T7：11肽序列

S：14肽序列HSV：11肽序列

VSV-G：11肽序列GSTSPA：葡萄球菌蛋白质AMBP：麦芽糖结合蛋白

GFP：绿荧光蛋白RFP：红荧光蛋白

VSV：vesicularstomatitisvirus，口蹄疫病毒第99页第99页第四节

DNA克隆基本过程

ProcedureofDNACloning第100页第100页目的DNA分离获取（分）载体选择与准备（择）目的DNA与载体连接（接）重组DNA转入受体细胞（转）重组体筛选与鉴定（筛）DNA克隆基本过程第101页第101页一、分离获取目DNA有多种办法（分）DNA克隆第一步是分离获取目的DNA。目的DNA起源有各种，包括基因组DNA、经mRNA反转录cDNA、PCR扩增产物、化学合成法取得DNA等。第102页第102页二、依据DNA克隆目的选择与准备

适宜载体（择）进行DNA克隆目的主要有二：①取得目的DNA片段；②取得目的DNA片段所编码蛋白质针对第一个目的，通常选取克隆载体；针对第二种目的，需选取表示载体选择载体时，还要考虑目的DNA大小、受体细胞种类和起源等原因选择载体时还需注意载体内应有适宜多克隆位点第103页第103页不同载体克隆容量及适宜宿主细胞载体插入DNA片段宿主细胞质粒<5~10kb细菌，酵母λ噬菌体载体~20kb细菌黏粒~50kb细菌BAC~400kb细菌YAC~3Mb酵母第104页第104页三、目DNA与适宜载体连接形成重组DNA（接）（一）黏端连接为最适连接

1.单一相同黏端连接会产生载体自连配伍末端连接情况与单一相同黏端连接相同第105页第105页载体和目DNA用EcoRI切割DNA连接酶粘性末端质粒载体目DNA重组DNA错误连接错误连接++单一相同黏端连接产生载体自连第106页第106页BamHI第107页第107页单一相同黏端连接存在下列缺点：容易出现载体本身环化目的DNA双向插入载体（即正向和反向插入）多拷贝现象采用碱性磷酸酶预处理线性化载体DNA，使之去磷酸化，可有效减少载体本身环化目的DNA假如反向插入载体，虽不影响基因克隆，但却影响外源基因表示

第108页第108页EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶重组体2.定向克隆可有效避免载体自连和DNA片段反向插入定向克隆：将待克隆DNA分子和载体分子采用同一对限制性核酸内切酶切割后连接起来，可实现外源DNA片段定向插入，此即定向克隆第109页第109页3.通过其它办法产生黏端进行连接①人工接头法②同聚物加尾法③PCR法④T-A克隆法

第110页第110页人工接头(adaptor或linker)连接由平端加上新酶切位点，再用限制酶切割产生粘性末端，而后进行黏端连接。

人工接头（adaptor/linker

）：是借助化学合成[和(或)结合退火办法]而得到含有一个或一个以上限制性内切酶切点平端双链寡核苷酸片段。5′---GGTG▼AATTCACC---3′3′---CCACTTAA▲GTGG---5′第111页第111页人工接头(adaptor/linker)连接CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ第112页第112页在末端转移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出黏端，再进行黏端连接。加同聚物尾

5′---GGTGAAAAAAACACC---3′3′---CCACTTTTTTTGTGG---5′

同聚物加尾连接第113页第113页同聚物加尾连接T(T)nT3´5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´3´T(T)nT

5´

3´3´5´A(A)nA3´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶重组体5´5´5´5´3´

A(A)nA第114页第114页PCR法产生黏端针对目标DNA5′和3′端，设计一对特异引物，在每条引物5′端分别加上不同限制性内切酶位点，然后以目标DNA为模板，经PCR扩增便可得到带有引物序列目标DNA，进而用对应限制性内切酶切割PCR产物，产生黏端，随即便可与带有相同黏端线性化载体进行有效连接。第115页第115页T-A克隆法在使用TaqDNA聚合酶进行PCR时，扩增产物3′末端可加上一个单独腺苷酸残基（A）而成为黏端，这样PCR产物可直接与带有3′-T线性化载体（T载体）连接，此即T-A克隆。

第116页第116页目基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体载体自连目基因自连（二）平端连接效率较低第117页第117页为了提升连接效率，可采用提升连接酶用量、延长连接时间、减少反应温度、增长DNA片段与载体摩尔比等办法平端连接同样存在载体本身环化、目的DNA双向插入和多拷贝现象等缺点第118页第118页（三）粘-平末端连接效率介于黏端和平端连接之间粘-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端方式进行连接以该方式连时，目的DNA为定向插入载体（即定向克隆）该连接方式连接效率介于黏端和平端连接之间可采用提升平端连接效率办法来提升该方式连接效率第119页第119页（四）快速连接法无需纯化DNA片段该办法从低融点琼脂糖凝胶中直接切下所需DNA片段，无需纯化，连同凝胶一起与载体DNA进行连接。本法省时省力，对DNA黏端和平端连接均合用，但其连接效率明显低于常规连接，且DNA连接酶用量大。第120页第120页四、重组DNA转入受体细胞（转）转化（transformation）

质粒或黏粒→细菌（感受态细胞，competentcell）质粒→酵母菌（真核细胞）转染（transfection）外源DNA→真核细胞（酵母除外）噬菌体DNA→感受态细菌感染（infection）噬菌体颗粒→细菌病毒颗粒→哺乳细胞第121页第121页受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺点处于感受态(competent)

细菌感受态（competentbacterium）：细菌易于接纳外源物质一个天然状态，在细菌对数生长前期，为了分裂增殖需要，细菌胞膜上会表示一些特殊蛋白质，利于外源物质穿透胞膜，帮助细菌吸取外源营养物质。基因工程操作中，通过物理化学办法也可使细菌处于感受态。处于该状态细菌被称为感受态细胞。第122页第122页将重组DNA转入受体细胞惯用办法化学法：氯化钙化学转化物理法：电击法显微注射法等第123页第123页用氯化钙化学转化第124页第124页电击法第125页第125页显微注射法第126页第126页五、筛选与鉴定重组DNA有各种办法（筛）普通一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列重组体。将目的重组体筛选出来就等于取得了目的序列克隆筛选与鉴定程序主要包括：先筛选出带有载体克隆；然后筛选鉴定出带有重组载体克隆；最后筛选鉴定出带有目的DNA克隆主要筛选和鉴定办法有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等第127页第127页（一）借助载体上遗传标志可快捷以便地进行筛选1.利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体重组子将含有某种抗生素抗性基因载体转入宿主细胞后，将细胞在含有相应抗生素培养基中培养，无载体转入细胞将被杀死，生长细胞即是含有载体细胞。至于细胞中载体是否为含有目的DNA重组载体，尚需进一步鉴定。第128页第128页抗药性标志筛选抗性平板第129页第129页2.利用标志补救筛选带有载体重组子标志补救（markerrescue）是指当载体上标志基因在宿主细胞中表示时，通过互补宿主细胞相应缺点而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体重组子。标志补救也可用于外源基因导入哺乳动物细胞后阳性克隆初筛。比如，当把带有dhfr标志基因真核表示载体导入dhfr缺点哺乳类细胞后，则可使细胞在无胸腺嘧啶培养基中存活，从而筛选出带有载体克隆。要拟定是否为带有重组载体阳性克隆，还需进一步鉴定。第130页第130页第131页第131页3.利用不同遗传标志可筛选出带有重组载体克隆（1）利用抗性基因插入失活可筛选带有重组载体克隆很多载体都带有抗生素抗性基因，当外源DNA插入某一抗性基因内，便可使该抗性基因失活。借助该抗性标志及载体上其它标志，便可筛选出带有重组载体克隆。第132页第132页插入失活筛选带有重组载体克隆第133页第133页（2）利用抗性基因插入表示也可筛选带有重组载体克隆

比如：质粒pTR262携带来自λ噬菌体CI基因，该基因在正常情况下表示产生阻遏蛋白，从而使tetR基因不能表示。当在CI基因中插入外源DNA后，将造成CI基因失活，从而使tetR基因去阻遏而表示。假如细菌内含有插入表示重组体，则可在含有四环素培养基上生长。第134页第134页（3）α-互补筛选利用了β-半乳糖苷酶功效互补基因片段

α-互补：pUC、pGEM及M13mp等载体系列均携带β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸残基（α片段）编码序列，在该序列中含有多克隆位点；通过改造宿主菌基因组DNA含有β-半乳糖苷酶C端（ω片段）编码序列。只有当载体与宿主细胞同时共表示该酶α和ω片段时，才干形成有活性β-半乳糖苷酶，该现象称为α-互补（alphacomplementation）。β-半乳糖苷酶可在诱导剂IPTG存在情况下，使底物X-gal转变为蓝色产物，使细菌克隆或噬斑呈蓝色。当外源DNA片段插入载体多克隆位点后，便不能表示α片段，转化细菌后不能分解底物，结果使菌落或噬斑呈现白色。因此，α-互补筛选又称蓝-白筛选

。第135页第135页α-互补筛选（蓝-白筛选）第136页第136页MCS有插入片段MCS无插入片段β-半乳糖苷酶X-Gal蓝色LacZ基因MCS载体上有β-半乳糖苷酶N端编码序列，细菌染色体DNA有β-半乳糖苷酶C端编码序列α-互补（蓝-白筛选）第137页第137页4.利用噬菌体包装特性可初筛带有重组载体克隆

λ噬菌体一个主要遗传特性就是其在包装时对λDNA大小有严格要求，只有重组λDNA长度达到其野生型长度75%～105%时，方能包装形成有活性噬菌体颗粒，进而在培养基上生长时呈现清楚噬斑，而不含外源DNA单一噬菌体载体DNA因其长度太小而不能被包装成有活性噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。第138页第138页（二）依据序列特异性可筛选出特定重组DNA

依据序列特异性进行筛选办法包括：限制性内切酶法PCR法核酸杂交法DNA测序法等

第139页第139页1.限制性内切酶法是依据限制酶切图谱筛选特定DNA

针对初筛为阳性克隆，提取其重组DNA，以适当限制性内切酶进行消化，经琼脂糖凝胶电泳便可判断有无DNA片段插入及插入片段大小。同时，依据酶切位点在插入片段内部不对称分布，可用该办法鉴定DNA片段插入方向；进而可用各种限制酶制作和分析插入片段酶切图谱。

第140页第140页限制性内切酶图谱分析

目的序列插入载体会使载体DNA限制性内切酶图谱（restrictionmap）发生改变，如插入目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观测到。第141页第141页2.PCR法可直接鉴定目的DNA存在利用序列特异性引物，经PCR进行扩增，可鉴定出阳性克隆。假如利用克隆位点两侧序列设计引物进行PCR，再结合序列分析，便能可靠地证实插入片段方向、序列和阅读框正确性。

第142页第142页3.核酸杂交法惯用于从文库中筛选目标DNA惯用方法是将转有外源DNA菌落或噬斑影印到硝酸纤维膜上，细菌裂解后所释放出DNA将吸附在膜上，将膜与标识核酸探针杂交，经过检测探针存在即可鉴定出含有重组DNA克隆。该方法又称为菌落或噬斑原位杂交（insituhybridizaiton）。依据核酸探针标识物不同，可经过放射自显影、化学发光、酶作用于底物显色等方法来显示探针存在位置（即阳性克隆存在位置）。第143页第143页菌落或噬斑原位杂交第144页第144页Southern印迹（SouthernBlot）第145页第145页4.核苷酸序列测定是最准确鉴定目的DNA办法

测定核苷酸序列办法主要有双脱氧链末端终止法和化学降解法，尤其以前者最为惯用。针对已知序列，通过测序可明确序列和阅读框正确性；针对未知序列，可明确序列顺序，为进一步研究提供依据。第146页第146页戊糖（RNA）1´2´3´4´5´核糖(ribose)（DNA）脱氧核糖(deoxyribose)第147页第147页DNA

序

列

测

定5′端3′端CGA第148页第148页DNA链末端合成终止法第149页第149页第150页第150页DNA自动测序采取荧光替换放射性核素标识是实现DNA序列分析自动化基础。用不同荧光分子标识四种双脱氧核苷酸（或同一测序引物），然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，经过四种激光激发不同大小DNA片段上荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基排列次序。第151页第151页DNA自动测序结果举例第152页第152页（三）亲和筛选法借助相关表示产物而筛选阳性克隆亲和筛选法前提是重组DNA进入受体细胞后能够表示出其编码产物。惯用亲和筛选法原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应。普通做法同上述菌落或噬斑原位杂交相同，只是被检测靶分子换成了吸附于硝酸纤维膜上蛋白质，检测探针换成了抗体/抗原或配体/受体。

Ab第153页第153页通过以上分、择、接、转、筛五个环节，便完毕了一次DNA克隆过程。有时为了达到某种新目的，需要对已克隆DNA进行再次克隆，该过程称为亚克隆。亚克隆目的有各种，常见有：①实现目的DNA高效扩增②表示目的DNA编码蛋白质③对目的DNA序列进行分析④对目的DNA进行修饰（如突变、缺失、引入新限制酶切位点等）⑤取得单链DNA或RNA⑥鉴定目的DNA是否含有一些特殊功效亚克隆（subcloning）及其目第154页第154页第五节

惯用原核、真核细胞表示体系FrequentlyUsedProkaryoticandEukaryoticExpressionSystems

第155页第155页一、原核细胞表示体系主要利用细菌

表示外源蛋白原核表示体系主要以细菌作为宿主细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、苏云金杆菌等，其中又以大肠杆菌表示体系应用最为广泛和最成熟。原核表示体系既可用于原核基因表示，也可用于真核基因表示。第156页第156页大肠杆菌(Escherichiacoli)

遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表示载体种类齐全，表示效率高不具备真核细胞蛋白质复性系统，真核基因在大肠杆菌中会合成错误空间构象多肽链，易形成包涵体(无正确折叠立体结构)无真核生物蛋白质加工系统，如糖基化磷酸化修饰等第157页第157页枯草杆菌(Bacillussubtilis)

分泌蛋白质能力强，普通有天然立体结构无糖基化修饰功效，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶水解质粒不稳定，尚无商品化表示载体第158页第158页其它宿主菌乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)

(可杀灭农林害虫，也可杀灭蚊、蝇等幼虫，不伤害害虫天敌，对人和动物安全无害——微生物杀虫剂)第159页第159页（1）将外源基因置于强启动子和SD顺序（核糖体结合位点）控制下（2）删除内含子和5′非编码区（3）维持正确开放阅读框架（ORF）（4）mRNA稳定且可被有效翻译和折叠，形成蛋白质不被降解

外源基因在原核表示体系中表示必要条件：正常转录与翻译第160页第160页（一）影响原核表示体系有效表示外源基因原因有多个1.目的基因构成序列是决定外源基因表示关键原因由于原核细胞缺乏转录后加工机制，无法切除内含子序列，故针对来自真核细胞基因，只能选择cDNA，不能使用基因组DNA真核基因mRNA无结合细菌核糖体SD序列，cDNA起始密码子上游非编码序列必须删除目的基因mRNA中密码子应是原核宿主细胞偏嗜密码子，不然，表示效率会减少要让目的基因正好插在启动子最佳