高效液相流动相缓冲盐选择

之袁州冬雪创作下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来讲，反相HPLC的活动相包含有机相和水相，有机相常常使用的为色谱甲醇和乙腈，不太常常使用的还有四氢呋喃和异丙醇甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可以与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的活络度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱才能比甲醇强，很少与样品发生反应，用作活动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm,增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可以性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇.但是当样品峰形欠好或者分离欠好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为分歧的溶剂可提供分歧的选择性.在反相色谱中，活动相中水相的pH和离子强度在开辟对条件微小变更不敏感的耐用方法中非常重要.对于离子型化合物，典型样品的保存随pH改变而分明变更，因此节制pH对于保存和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保存时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开辟的起始pH,包含碱性化合物和一般的弱酸•思索到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位.当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上活动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好成果.对活动相的优化主要体现在

水相上•活动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的布局性质，pH可以影响选择性、峰形和保存•如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保存的影响一般不分明.如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保存因子和选择性随pH改变非常分明.（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液活动相，以防止分析物离子化•懂得分析物的pKa，才干有效的选择活动相pH.缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1pH单位，使活动相的优化具有一定的矫捷性•例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8.（2）碱性化合物，在高pH条件下才干得到其非离子形态，但这对色谱柱晦气•通常许多碱性化合物在低pH条件的保存就已经知足要求了，所以可选择低pH条件•如果选择高pH条件，则注意需选择耐强碱的色谱柱.水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变pH值、改善峰形、提高分离度•常常使用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等.单纯做液相时，低波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸.开辟液相分析方法时活动相可首选0.1%的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化.在单独用酸不成的时候再思索使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲才能强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱•常常使用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，还有醋酸盐，常常使用的盐浓度在10~20mM左右（根据实际情况，有时可

以选择更低或更高浓度，建议最高浓度不超出50mM）.下表是Waters提供的一个资料，惯例实验室建议使用的缓冲盐体系.缓冲盐/活动相改性剂pKa缓冲范围挥发性？仕1pH）是否MS兼容？备注TFA-是是离子对试剂，可以抑制MS信号，通常使用的浓度范围0.02~0.1%乙酸-是是同乙酸铵一起使用具有最大的缓冲才能，通常使用的浓度范围0.1~1.0%甲酸-是是同甲酸铵一起使用具有最大的缓冲才能，通常使用的浓度范围0.1~1.0%乙酸盐（铵盐）是是通常使用1~10mM浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的甲酸盐（铵盐）是是通常使用1~10mM浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的磷酸盐1否否传统的低pH缓冲体系，UV透光度很好磷酸盐2否否当pH超出7时，降低操纵温度/缓冲盐浓度以及使用呵护柱可以延长色谱柱寿命磷酸盐3否否当pH超出8时，降低操纵温

度/缓冲盐浓度以及使用呵护柱可以延长色谱柱寿命4-甲基吗啡啉是是通常使用浓度为10mM或更少氨水碳酸氢铵9.210.3(HCO3-)9.2(NH4+)是是通常使用浓度为5~10mM（用于MS工作时坚持离子源温度超出150C）.用氨水或乙酸调节pH值，在pH10时具有很好的缓冲才能.乙酸铵是是通常使用浓度为1~10mM甲酸铵是是通常使用浓度为1~10mM硼酸否否降低温度，减少浓度并使用色谱柱来延长柱寿命CAPSO（3-环己胺基-2-羟基丙磺酸否否两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为1~10mM,气味小Glycine甘氨酸否否两性离子缓冲液，比使用硼酸盐对柱子的损伤更小些1-甲基哌啶是是通常使用浓度为1~10mMCAPS否否两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为1~10mM,气味小三