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文档简介

免疫扩散实验双向双扩散——生物技术四组第1页/共14页免疫扩散实验(双向双扩散)2010级生物技术第四组第2页/共14页实验目的了解双向琼脂扩散的原理和用途。掌握抗体效价的测定方法。观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。第3页/共14页实验原理双向双扩散简称双扩散,此法是一种定性试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散,如果抗原和抗体相对应,则在二者比例适当处形成白色沉淀线;若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。此试验可以检测抗原或抗体的纯度,滴定抗体的效价,以及用已知抗原(抗体)检测和分析未知抗体(抗原)。第4页/共14页实验材料生理盐水、1%琼脂(用于制作琼脂扩散试验平板)已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪瓷盒等第5页/共14页实验步骤制板:称取1g琼脂粉,加入100ml生理盐水,煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中,厚度为2-3mm。注意勿产生气泡。打孔:待琼脂凝固好后用打孔器打孔,孔径和孔距依不同疫病检疫规程而定,一般孔径3~5mm,孔间距4~7mm。孔型多为7孔,中央1孔,周围6孔(如梅花孔)。用针头挑出孔内琼脂。封底:将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧,用手背感受微烫即可。第6页/共14页抗体效价测定:用微量加样器于中央孔加入已知抗原,于周围孔加倍比稀释的血清,每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结果。扩散:加样完毕后,将琼脂板放于湿盒内,保持一定的湿度,置于37℃温箱中扩散24~48小时观察结果。第7页/共14页图1第8页/共14页结果判定用以检测抗原或比较抗原差异时,将抗血清置中心孔,将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合,证明为同种抗原;若二者有部分相连,表明二者有共同抗原决定簇;若二条沉淀线相互交叉,说明二者抗原完全不同。第9页/共14页用梅花孔检测抗血清的效价,操作时将抗原置于中心孔,抗血清倍比稀释后置于周围孔,以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼扩效价。若凝胶中抗原、抗体是特异性的,则形成抗原抗体复合物,在两孔之间出现清晰致密的白色沉淀线,为阳性反应。若在72小时内仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与备检样品的沉淀线发生融合,才能确定待检样品为真正阳性。结果判定第10页/共14页

双向免疫扩散凝胶染色图第11页/共14页第12页/共14页注意事项浇制琼脂板时要均匀、无气泡。孔要打得圆整光滑,边缘不要破裂。加样时应尽量避免气泡或加到孔外,以保证结果的准

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