紫外可见分光度法

紫外可见分光度法第一页，共一百零八页，2022年，8月28日分光：将复合光变成单色光叫分光可见光（400-760nm）红橙黄绿青蓝紫红外紫外610-780400-435分光系统第二页，共一百零八页，2022年，8月28日特点：灵敏度高（10-6g/ml），简单方便。应用：1、定性分析2、定量分析发展趋势：与计算机联用及某些数学联用（如导数光谱）

紫外光谱主要产生于分子价电子在电子能级间的跃迁，属于电子光谱第三页，共一百零八页，2022年，8月28日图3-1分子能级跃迁示意图V.振动能级J.转动能级（一）光谱的产生E=E内+E平+E振+E转+E电子

E内是分子固有的内能，E平是连续变化的，不具有量子化特征,故ΔE=ΔE振+ΔE转+ΔE电子其中ΔE电子最大，一般为1eV～20eV，(1250nm～60nm)。由外层电子跃迁而产生的光谱位于紫外-可见光区（一）光谱的产生§1基本原理第四页，共一百零八页，2022年，8月28日分子能级跃迁示意图V.振动能级J.转动能级第五页，共一百零八页，2022年，8月28日（二）电子跃迁：有机化合物分子中主要含有的价电子类型:

形成单键的σ电子；形成双键或叁键的π电子及未成键的n电子(亦称p电子)。各分子轨道能级高低顺序是：σ＜π＜n＜π*＜σ*σ、π表示成键分子轨道，n表示未成键分子轨道（亦称非键轨道），σ*、π*表示反键分子轨道。第六页，共一百零八页，2022年，8月28日在紫外-可见光区内，有机化合物的吸收光谱主要由σ→σ*、π→π*、n→σ*及n→π*跃迁产生。第七页，共一百零八页，2022年，8月28日不同类型电子跃迁能量与波段示意图第八页，共一百零八页，2022年，8月28日分子吸收何种光（λ）与能级差（△E）有关吸收强度大小（ε）则与跃迁机率有关,同型轨道之间跃迁几率大。△EλI0I第九页，共一百零八页，2022年，8月28日σ→σ*跃迁：特点:能级间隔△E大，λmax小，一般λmax<150nm，远紫外吸收。第十页，共一百零八页，2022年，8月28日（2）π→π*跃迁：△E小a单个π键，λmax=200nm，末端吸收b共轭π键，λmax=210-250nm，ε>104。200nmλA末端吸收

具有C＝C或C≡C、C＝N等基团的不饱和有机化合物都会产生π→π*跃迁第十一页，共一百零八页，2022年，8月28日（3）n→π*跃迁含有杂原子的不饱和基团，如C＝O、C＝S、N＝N等化合物，其未成键轨道中的n电子吸收能量后，向π*反键轨道跃迁△E更小，λmax>250nm，ε=10-100。丙酮的λmax＝279nm第十二页，共一百零八页，2022年，8月28日(4)n→σ*跃迁含－OH、－NH2、－X、－S等基团的化合物，其n电子吸收能量后向σ*反键轨道跃迁λmax=200nm，末端吸收。第十三页，共一百零八页，2022年，8月28日二常用术语吸收曲线(吸收光谱):以波长λ（nm）为横坐标，以吸光度A为纵坐标所描绘的曲线。第十四页，共一百零八页，2022年，8月28日吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（λmax）。谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（λmin）。末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称末端吸收。Aλ吸收峰肩峰（sh）吸收谷末端吸收λmaxλmin第十五页，共一百零八页，2022年，8月28日发（生）色团：是指能在紫外-可见波长范围内产生吸收的原子团，如C＝C、C＝O、－C＝S、－NO2、－N＝N－等特点:结构中含有π→π*或n→π*跃迁的基团第十六页，共一百零八页，2022年，8月28日助色团：是指本身不吸收紫外可见光，但与发色团相连时，可使发色团所产生的吸收峰红移并使吸收强度增加的原子或原子团。如－OH、－OR、－NH2、－SH、－X等。第十七页，共一百零八页，2022年，8月28日红移（长移）：吸收峰向长波方向移动。如助色团、共轭键的影响。蓝移（短移）：吸收峰（λ）向短波方向移动。如共轭键减少或溶剂的影响。浓色效应和淡色效应：使吸收强度（ε）增加称浓色效应。反之称为淡色效应或减色效应。强带和弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡εmax大于104的吸收峰称为强带，凡εmax小于103的吸收峰称为弱带。第十八页，共一百零八页，2022年，8月28日三吸收带紫外-可见光谱为带状光谱，紫外-可见光谱中吸收峰称为吸收带R带：由n→π*跃迁引起的吸收带。如C＝O、－NO、－NO2、－N＝N－等特点：（1）λmax>250nm（2）ε<100，为弱吸收（3）溶剂的极性越大，λmax越小200nm250nm第十九页，共一百零八页，2022年，8月28日例当有强吸收峰在其附近时，R带有时红移，有时被掩盖第二十页，共一百零八页，2022年，8月28日K带：由共轭双键中π→π*跃迁所产生的吸收峰。如1,3-丁二烯。特点：（1）λmax=210-250nm（2）ε>104，为强吸收（3）溶剂的极性越大，λmax越大200nm250nm第二十一页，共一百零八页，2022年，8月28日π-π

*跃迁，K带第二十二页，共一百零八页，2022年，8月28日π→π*跃迁，K带n→π*跃迁，R带，，200nm300nmAλK带R带第二十三页，共一百零八页，2022年，8月28日B带：苯环骨架振动和环内共轭π→π*重叠所致，是芳香族化合物的特征吸收带。特点:(1)在非极性的溶剂中，B带230-270nm产生细微振动第二十四页，共一百零八页，2022年，8月28日（2）在极性的溶剂中，细微结构消失，重心在256nm附近，ε在200左右。（3）被取代时，细微结构消失（4）B带是有机化合物的特征谱带蒸气在环已烷中在水中240nm260nm256nm第二十五页，共一百零八页，2022年，8月28日E带：由苯环结构中三个乙烯的π→π*所产生，分为E1和E2带。是苯环的特征吸收谱带。E1带：λ＝180nm，ε＝6×104

。E2带：λ=200nmε＝8×103

。第二十六页，共一百零八页，2022年，8月28日例：B带λmax增大，282nmE2带与K带合并，移至210-250nmBRK

当苯环上有发色团取代并共轭时，E2带与K带合并，吸收带长移，且使B带长移。第二十七页，共一百零八页，2022年，8月28日logε1030020010050040070060080012345远紫外区近紫外区可见光区σσ*ππ*π*σ＊nn波长(nm)几种常见的紫外与可见吸收光谱π*nR带K带R带第二十八页，共一百零八页，2022年，8月28日运用：预测一个化合物的吸收带可能出现的范围及吸收带的类型。R带（250-500nm）π*n共轭K带（210-250nm）ππ

*第二十九页，共一百零八页，2022年，8月28日影响吸收带的因素1.位阻影响立体空间结构影响共轭效应。顺式二苯乙烯反式二苯乙烯同分异构体：第三十页，共一百零八页，2022年，8月28日2.跨环效应3.溶剂效应：除了影响吸收峰（λ）位置外，还影响吸收强度（ε）和光谱形状。溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响跃迁类型正已烷氯仿甲醇水迁移π

-π

*230238237243长移n

-π

*329315309305短移第三十一页，共一百零八页，2022年，8月28日4.体系pH值的影响：主要是对弱酸弱碱性物质的影响。非极性溶剂极性溶剂非极性溶剂极性溶剂n→π*跃迁

π→π*跃迁

第三十二页，共一百零八页，2022年，8月28日§2Lambert-Beer定律一.参数1.入射光的强度I0I0b2.透射光的强度ItIt3.透光率T＝It/I0

百分透光率T％＝I/I0×100％4.比色池厚度：b5.样品浓度：C（mol/l，％）6.吸光度：A＝－lgT=lg(I0/It)第三十三页，共一百零八页，2022年，8月28日二.Lambert-Beer定律Lambert定律：C一定，A＝-lgT=K1bBeer定律：b一定，A＝-lgT=K2c两定律合并：A＝a·b·ca=K1K2a为吸收系数注：吸光度A是指某一波长（λ）下的吸光强度即入射光为单色光第三十四页，共一百零八页，2022年，8月28日吸收系数：摩尔吸收系数(ε)：在一定条件下，当C＝1mol/l，b=1cm时的吸光度。百分吸收系数（）：一定条件下，当C＝1％，b=1cm时的吸光度。第三十五页，共一百零八页，2022年，8月28日特征：1）ε、E均为特征常数2）ε、E是有条件的，同一物质，不同条件下所测值不同（波长不同、溶剂不同、温度不同等）。3）ε、E越大，测定吸光度灵敏度越高。4）ε=104-105为强吸收，103-104为中吸收，<103为弱吸收。第三十六页，共一百零八页，2022年，8月28日例：紫草素（C16H6O5288.3），2.00mg溶于100.0ml乙醇中，b=1cm，λmax=516nm，A=0.484.求ε、E注：若溶液中存在多种吸光物质时，吸光度将是各组分吸光度的总和。A总＝Aa+Ab+Ac+……＝εadCa+εbdCb+εcdCc+……I0a、b、cId注：每种物质的吸收度仅由本身的性质和C决定，与其它物质无关。第三十七页，共一百零八页，2022年，8月28日吸光度A具有加和性，对同一物质来说浓度（C）吸光度（A）001CA2C2A3C3A4C4A线性范围：线性范围越大越好。工作曲线CA负偏离正偏离C1第三十八页，共一百零八页，2022年，8月28日三、偏离Beer定律的因素1)化学因素：离解、缔合、配位等化学变化，使吸光物质形态发生变化。溶剂、pH、温度等影响。A＝a·b·c影响吸收系数a的因素有：1、物质的性质2、测定波长3、其它因素如溶剂的影响等第三十九页，共一百零八页，2022年，8月28日ε×104亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱abc(a)6.36×10-6mol/l(b)1.27×10-4mol/l(c)5.97×10-4mol/lCA负偏离610nm660nm第四十页，共一百零八页，2022年，8月28日2、光学因素（1）单色光的纯度Beer定律前提：入射光是单色光。第四十一页，共一百零八页，2022年，8月28日单色光I0I单色器复合光狭缝I0比色池760nm400nm可见光单色光的谱带宽s=λ2-λ1510-520谱带宽度的值愈小，单色性愈好。第四十二页，共一百零八页，2022年，8月28日（2）杂散光:与所需波长相隔较远的光。IoIsIIs<第四十三页，共一百零八页，2022年，8月28日（4）非平行光（3）散射、反射克服方法：比色池：擦干净溶液：溶液均一，透明；用空白作参比。克服方法：比色池位置放正确，与光路垂直。第四十四页，共一百零八页，2022年，8月28日三、透光率测量误差透光率测量误差（ΔT），来自仪器的噪声。ΔC与T和ΔT有关第四十五页，共一百零八页，2022年，8月28日不同T%或A时的浓度相对误差

第四十六页，共一百零八页，2022年，8月28日结论：当A值在0.2-0.7，相对误差较小，是测量最适宜范围。第四十七页，共一百零八页，2022年，8月28日§3显色反应及其显色条件的选择能吸收紫外光的物质可用紫外光度法直接测定，无色或颜色浅的物质，通常选用显色反应来测定。显色反应:选用适当的试剂与被测物质定量反应生成有色的物质再进行测定的分析方法。显色反应中所用的试剂称为显色剂。Fe2+与邻二氮菲能生成稳定的红色配合物λmax=510nm(ε＝11000)，可用此反应测定定微量铁第四十八页，共一百零八页，2022年，8月28日一、显色反应的选择一般为配位反应、氧化还原反应、缩合反应要求：1、定量关系明确2、灵敏度高3、产物稳定性好4、显色剂无干扰（一般相关60nm以上）5、选择性好第四十九页，共一百零八页，2022年，8月28日二、显色条件的选择提高反应灵敏度、选择性、稳定性1、显色剂的用量通常需要加入过量的显色剂ababAACC第五十页，共一百零八页，2022年，8月28日2、溶液酸度影响显色剂存在形式和显色产物的浓度第五十一页，共一百零八页，2022年，8月28日3、显色时间abAt注：确定实验方法要考察稳定性。第五十二页，共一百零八页，2022年，8月28日4、显色温度：显色反应结果与温度有关。5、溶剂苦味酸在水溶液中呈黄色，而在氯仿中呈无色●显色反应产物的稳定性也与溶剂有关●有些物质溶解于不同的溶剂中，会出现不同的颜色第五十三页，共一百零八页，2022年，8月28日三、测量条件的选择干扰物质的影响●干扰物质本身有颜色或无色但与显色剂形成有色化合物，且有吸收●干扰物质水解，析出沉淀使溶液混浊●与待测离子或显色剂形成更稳定的化合物，使显色反应不能进行完全第五十四页，共一百零八页，2022年，8月28日消除干扰的方法：1、控制酸度控制合适的酸度可提高反应的选择性2、选择适当的掩蔽剂3、使其生成惰性配合物第五十五页，共一百零八页，2022年，8月28日4、选择合适的测量波长选择原则“吸收最大，干扰最小”测定波长一般选择在被测组分最大吸收波长处，此时A较大，测定灵敏度高如出现多个λmax，应选择干扰最小，A较大且平坦处的最大吸收波长第五十六页，共一百零八页，2022年，8月28日KMnO4的测定一般选择其525nm的λmax，如在K2Cr2O7存在下测量KMnO4，则应选择另一最大吸收波长λ=545nm第五十七页，共一百零八页，2022年，8月28日5、选择适宜的空白（参比）溶液吸光度值应只反映被测物质对光的吸收，要扣除其它因素的影响（溶剂、试剂、器皿、试样都可能引入干扰）常用的空白溶液：第五十八页，共一百零八页，2022年，8月28日①溶剂空白：用溶剂作为空白溶液

适用于在测定长波长下，溶液中只有被测组分对光有吸收，显色剂及其它组分对光没有吸收，或吸收很小第五十九页，共一百零八页，2022年，8月28日②试剂空白：在相同条件下依次加入各种试剂和溶剂（不加试样溶液）所得到的空白溶液。适用于在测定条件下，显色剂或其他试剂、溶剂对待测组分的测定有干扰情况第六十页，共一百零八页，2022年，8月28日③试样空白：在与显色反应同样条件下取同样量试样溶液，只是不加显色剂所制备的空白溶液。

适用于试样基体有色并在测定条件下有吸收，而显色剂溶液不干扰测定，也不与试样基体显色的情况其它空白：不显色空白、平行操作空白等第六十一页，共一百零八页，2022年，8月28日6、分离利用化学反应、萃取、色谱分离等方法除去干扰物质第六十二页，共一百零八页，2022年，8月28日控制吸光度测量范围吸光度控制在0.2-0.7。方法：调节溶液的浓度改变吸收池的厚度第六十三页，共一百零八页，2022年，8月28日§4紫外-可见分光光度计单色光I0I单色器复合光狭缝I0比色池检测器记录在紫外-可见光区可任意选择不同波长的光测定吸光度的仪器

第六十四页，共一百零八页，2022年，8月28日（一）光源要求：发射强度高、稳定、具有连续光谱●钨灯和钨卤灯：波长覆盖宽，但紫外区很弱。常取波长大于350nm的光为可见区光源●氢灯和氘灯：发出波长为150-400nm的连续光谱。一、主要部件第六十五页，共一百零八页，2022年，8月28日（二）单色器从光源的连续光谱中分出单色光组成：进口狭缝、准直镜、色散元件、出口狭缝单色器光路示意图第六十六页，共一百零八页，2022年，8月28日1）色散元件：棱镜和光栅棱镜:利用其对不同波长的光有不同的折射率。缺点：色散后光谱按波长排列疏密不均，长波区密，短波区疏。为非均匀分布光谱。分光系统红紫第六十七页，共一百零八页，2022年，8月28日光栅:利用光的干涉作用。特点：色散后的光谱，各谱线间距离相等，为均匀分布的连续光谱。第六十八页，共一百零八页，2022年，8月28日2）准直镜：以狭缝为焦点的聚光镜。将发散光变为平行光，将色散后的平行光聚焦。第六十九页，共一百零八页，2022年，8月28日3）狭缝：狭缝宽度直接影响分光质量。过宽，单色光不纯，太窄，光通量小，降低灵敏度。第七十页，共一百零八页，2022年，8月28日（三）吸收池（比色池、比色皿）●玻璃比色皿，只能用于可见光区。●石英比色皿，可用于紫外光区和可见光区。●型号有：0.5、1.0、2.0、5.0cm第七十一页，共一百零八页，2022年，8月28日（四）检测器将光能转变成电能的装置。光电池：是一种光敏半导体。要求：灵敏度高，噪声低分类：硒光电池和硅光电池。特点：光电流大小与照射光强成正比。光电流不易放大，光强弱时，不能测量。易“疲劳”，不能长时间使用。A第七十二页，共一百零八页，2022年，8月28日光电管光阳极光敏阴极放大器指示器特点：电流可放大，较有高灵敏度。有“疲劳现象”第七十三页，共一百零八页，2022年，8月28日光电倍增管光电倍增管大大提高了仪器测量的灵敏度。第七十四页，共一百零八页，2022年，8月28日光二极管阵列检测器：由一系列的二极管紧密排列在一块硅晶体片上组成。光例：HP8452A型二极管阵列：波长范围为190-820nm，二极管316个。λA特点：测量速度快第七十五页，共一百零八页，2022年，8月28日（五）信号显示系统（记录系统）分类：指针显示数字显示第七十六页，共一百零八页，2022年，8月28日二、分光光度计的类型1、单光束分光光度计特点：仪器结构简单，灵敏度高，但对光源发光强度稳定性要求高。第七十七页，共一百零八页，2022年，8月28日2、双光束分光光度计特点：可减免因光源强度不稳而引入的误差，但灵敏度较单光束差。第七十八页，共一百零八页，2022年，8月28日3、双波长分光光度计将同一光源发出的光分为两束，分别经过两个单色器，从而可以同时得到两个波长（λ1和λ2）的单色光，两个波长的单色光交替地照射同一溶液，检测其信号能测定高浓度试样，多组分混合试样及浑浊试样第七十九页，共一百零八页，2022年，8月28日4、二极管阵列检测的分光光度计特点：全波长测定，测定速度快。第八十页，共一百零八页，2022年，8月28日§5分析方法一、定性方法光谱特征：光谱形状、吸收峰数目、吸收峰

波长、强度和吸收系数定性依据：1、结构相同的化合物在相同条件下有完全相同的吸收光谱第八十一页，共一百零八页，2022年，8月28日2、吸收光谱不同，一定不是相同物质。3、吸收光谱相同，可能是相同物质。定性鉴别方法：对比法▲将样品与对照品的光谱进行对照、比较▲将样品光谱与标准图谱进行比较第八十二页，共一百零八页，2022年，8月28日1、比较吸收光谱三种甾体激素的紫外吸收光谱（10mg/ml甲醇溶液）第八十三页，共一百零八页，2022年，8月28日2、比较吸收光谱的特征数据比较λmax、ε或例2安宫黄体酮（Mr=386.5）和炔诺酮（Mr=298.4）λmax240±1nm=408λmax240±1nm=571第八十四页，共一百零八页，2022年，8月28日3、比较吸光度（吸光系数）的比值不只一个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度比值作为鉴别的依据。可消除绝对误差(或浓度、吸收池厚度)。第八十五页，共一百零八页，2022年，8月28日例3《中国药典》（2005年版）对维生素B12采用下述方法鉴别：将检品按规定方法配成25mg/ml的溶液，分别测定278nm、361nm和550nm处的吸光度A1、A2和A3，A2/A1应为1.70～1.88；A2/A3应为3.15～3.45。第八十六页，共一百零八页，2022年，8月28日推测分子骨架、判断发色团之间的共轭关系、估计共轭体系中取代基的种类、位置及数目等二、结构分析第八十七页，共一百零八页，2022年，8月28日1、从吸收光谱中初步推断官能团紫外光谱提供的信息①化合物在220～700nm内无吸收，其可能是脂肪烃、脂环烃或其衍生物，还可能是非共轭烯烃②220～250nm范围有强吸收带说明分子结构中存在一个共轭体系（共轭二烯或α、β-不饱和醛、酮）第八十八页，共一百零八页，2022年，8月28日③200～250nm范围有强吸收带（lgε3~4），250-290nm范围有中等强度吸收带（lgε2-3）或有精细结构，说明结构中含有苯基④250～350nm范围有弱吸收带（R带），说明分子结构中含有醛、酮羰基或共轭羰基。⑤300nm以上的强吸收带，说明化合物具有两个以上较大的共轭体系。若吸收强且具有明显的精细结构，说明为稠环芳烃、稠环杂芳烃或其衍生物。第八十九页，共一百零八页，2022年，8月28日2、判断顺反异构体空间位阻的影响第九十页，共一百零八页，2022年，8月28日3、判断互变异构体某些有机物在溶液中可能有两个或两个以上容易互变的异构体。例如，乙酰乙酸乙酯是比较典型的具有酮式和烯醇

式互变异构的化合物：酮式烯醇式在204nm处有弱吸收在245nm处有强吸收第九十一页，共一百零八页，2022年，8月28日三、纯度检查利用待测物与杂质在紫外-可见光区吸收的差异，选用适当波长可以进行待测物的纯度检查肾上腺素（虚线）与肾上腺酮的吸收光谱《中国药典》（05版）中规定2mg/ml的样品溶液在310nm处的吸收度不得超过0.05，限量为0.06%（吸收系数为453）。第九十二页，共一百零八页，2022年，8月28日四、定量分析（一）单组分分析常用的单组分定量分析方法有标准曲线法、标准对照法、吸收系数法等第九十三页，共一百零八页，2022年，8月28日1、工作曲线法（标准曲线法）步骤：①标准曲线的绘制配制系列浓度标准溶液，测定吸光度，绘制曲线。②测定样品吸光度。③从标准曲线或回归方程中求样品浓度。第九十四页，共一百零八页，2022年，8月28日标准曲线法应注意的问题（1）制备一条标准曲线至少要5~7个点（2）待测液浓度应包括在标准曲线浓度范围内（3）供试品溶液和对照品溶液必须在相同的操

作条件下测定。（4）仪器更换元件，维修或重新校正波长时，

必须重新制作标准曲线。第九十五页，共一百零八页，2022年，8月28日不过原点的原因：（1）空白溶液的选择不当，不能完全消除