肿瘤病理生物学-肿瘤的分子病理诊断技术

肿瘤的分子病理诊断技术

2017-9-15

第一节细胞与分子诊断在

肿瘤研究中的应用和意义

一、肿瘤易感基因的检测研究发现部分肿瘤的发生具有分子遗传学基础，肿瘤易感基因的检测对肿瘤高危人群的筛选具有实用价值。主要的肿瘤易感基因包括：肿瘤易感基因Rb1(视网膜母细胞瘤基因）WT1(肾母细胞瘤基因）P53(Li-Fraumeni综合征)APC(家族性腺瘤性息肉病)Rb1(视网膜母细胞瘤基因）WT1(肾母细胞瘤基因）P53(Li-Fraumeni综合征)APC(家族性腺瘤性息肉病)

二、肿瘤的分类肿瘤克隆起源和异质性还存在诸多未知机理，目前使用的肿瘤分类、分型标准还无法反应肿瘤的生物学行为特点，包括诊断、预后等生物学指标。

三、肿瘤的早期诊断蛋白质水平肿瘤相关抗原和胚胎抗原(如AFP、CEA等)分子水平基因扩增、等位基因缺失、基因突变、甲基化等

肿瘤的早期诊断目前尚缺乏敏感性高、特异性强、成本低、操作简易的筛检靶点和手段，但在分子水平上寻找早期诊断的靶点是努力的方向。各种肿瘤发生发展分子模型的建立将有助于这一领域的研究进展。

四、肿瘤的预后判断和监测

在分子水平上为肿瘤预后判断提供指标已进行了很多有价值的研究，其中癌基因、抑癌基因、肿瘤转移抑制基因、细胞外粘附分子等的状态,可为肿瘤预后提供参考指标

五、肿瘤的个体化和靶向治疗

在分子水平上检测肿瘤基因的变化,提出对肿瘤的个体化和预见性治疗意见。

如

癌基因的检测基因突变的检测基因甲基化状态的检测

第二节肿瘤基因过表达及其检测方法

基因过表达的形式癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤基因异常的主要形式。基因过表达可表现为翻译(蛋白质)、转录(RNA)和基因拷贝数(DNA)增加三个水平。

一、基因过表达的检测

蛋白产物的检测酶联免疫吸附(ELISA)技术蛋白免疫印渍(Westernblot)技术免疫组织化学(IHC)检测技术流式细胞仪

反义正义正义反义pcDNA3pcDNA3wpt53pcDNA3wtp53pcDNA3pcDNA3wpt53pcDNA3wtp53

转染正义和反义野生型p53后SMMC-7721细胞和Hep3B细胞的p53

蛋白的表达

SMMC-7721细胞Hep3B细胞

1pcDNA32pcDNA3HBx3pcDNA3HBx3-40

123ß-actin

ß-actin

ß-actin

PCDNA3-p33ING1b

和wt-p53

PCDNA3-p33ING1b

PCDNA3-αp33ING1b

PCDNA3

流式细胞仪技术二、免疫组织化学检测技术

免疫荧光间接法EnVision法(多聚物)

S-P法/LSAB法(亲和细胞化学)

CSA法PAP法图(A-F)为免疫组化各种方法结果图：A-B为免疫荧光直接法,接间法;C.IGSS法-P53;D为S-P法肺肿瘤组织中的EGFR;E为CSA法-CD44v6;F为EnVision法-HPC阳性

三、原位杂交检测技术

原位杂交(ISH)是指应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体,用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法，在核酸原的位上把它显示出来。

核酸探针根据标记物

根据探针的核酸性质核酸探针的分类DNA探针锁核酸探针RNA探针cDNA探针cRNA探针寡核苷酸探针放射性探针

非放射性探针探针种类优点缺点cDNA1、制备简单2、放射比活性高3、信号特异性强4、杂交体较稳定1、变性后才能使用2、要通过基因克隆制备3、组织穿透力差4、易于退火，敏感性稍差cRNA1、信号特异性强2、不需变性3、杂交后可用RNase除去未杂交探针因而信噪比高4、杂交体非常稳定5、不会退火1、易被RNase降解2、易吸附于器皿上3、组织穿透力差4、需做亚克隆5、模板需线性化寡聚核苷酸1、易制备2、使用方便3、组织穿透力强4、不需做克隆5、不会退火6、只要知道氨基酸顺序便可制备探针1、需核酸合成仪2、需明确mRNA顺序3、单碱基错误将影响杂交4、杂交体不太稳定5、信/噪比偏低6、需做多种对照cDNA、cRNA和寡聚核苷酸探针的优缺点比较

原位杂交目标

DNA—DNAcDNA—RNA，

RNA—RNA

寡核苷酸—DNA或RNAmiRNA

杂交对象

组织

活细胞

细胞学石蜡切片冰冻切片爬片收集细胞涂片

杂交形式漂浮法贴片法

原位杂交技术类型原位杂交-ISH

-FISH:单色FISH和双色FISH

-CISH:单色CISH和双色CISH

-GOLDFISH

-同位素标记原位杂交RNAscope技术LSIHER-2和CEP17

FISH原位杂交检测乳腺癌肿瘤细胞中的HER-2基因的扩增，包括基因片段的扩增和染色体倍数的扩增

发色原位杂交(ChromogenicinSituHybridization;CISH)技术是将免疫组化的显色反应与原位杂交技术相结合,原位检测特异性DNA片段或染色体移位或染色体畸变

CISH技术CISH高拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有多于10个信号点或者凝结成团块状、簇状信号颗粒双色银染原位杂交(DSISH)

Her2/CEN17EGFR/CEN7银染原位杂交:靶向DNADNP标记的HER2探针or17号染色体探针兔抗2，4二硝基苯酚（DNP）单抗HRP标记的羊抗兔二抗多聚体SISHChromogens:A=醋酸银B=对苯二酚C=过氧化氢ABCMETALDEPOSITION

Silverisprecipitatedwhensilverions(A)arereducedtoMetallicsilveratomsbyHydroquinone(B).ThisreactionisfueledbythesubstrateforHRP,hydrogenperoxide(C).60X肿瘤细胞组织异质性。绿色箭头显示

HER2簇装扩增；橙色箭头显示

HER2

非扩增。ISH双色银染原位杂交HER2

非扩增●HER2●CEN17HER2

扩增60X组织异质性。绿色箭头显示

HER2簇装扩增；橙色箭头显示

HER2

非扩增。HER2双色银染RNAscope®探针引物设计

信号放大原理RNAscope原位杂交技术双Z形探针设计级联放大检测RNAscope技术特点RNAscope®探针引物设计RNAscope®采用类似于荧光共振能量转移（FRET）的设计原理。两个独立的引物探针(Z形引物对)需要随机与目标序列互补结合，以实现信号放大。两个独立引物相互紧挨同时相互互补结合到一个非目标序列的可能性非常小，这种设计原理保障了对目标信号的特异性放大。对于任意一个目标RNA序列，都有一组独特设计的20对Z形引物探针(包含一个18~25个碱基序列与靶RNA碱基互补的区域)对,只针对该目标序列具有互补杂交特异性，而不会结合到非目标片段上。己知靶目标必须大于300bp。每一个Z形探针包含三个结构元素:①Z型探针底部是一个18-25左右碱基长度的序列能够互补结合到目标RNA上。这个序列是基于目标序列的不同，以及独特的结合特征而进行的特异性设计。RNAscope®探针特点②Z型探针的中部是一个间隔序列，链接了探针的上下两端。③Z型探针的顶端是一个14碱基长度的尾部序列。因而一对Z形探针对的顶端序列组合成一段28个碱基长度的结合区以供信号放大前体序列的结合。信号放大原理

信号的放大由一系列的杂交组合串联事件最终实现⑴20组Z形探针对互补结合到1KB长度的目标RNA上。⑵信号放大前体序列结合到一对Z形探针顶端拼接而成的28个碱基长度的结合区域。⑶信号放大序列进一步结合到信号放大前体序列上的20个互补结合区。⑷带有荧光分子标记或者显色酶标记的引物结合到信号放大序列上的20个互补结合区。

RNAscope®技术的优势⑴灵敏度每三对Z形探针对就足以实现对一个RNA分子的检测。在RNA分子出现部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情况下，20对Z形探针对的设计保障了足够强劲有效的检测RNA。②特异性Z形探针对的设计屏蔽了背景噪音。单独一个Z形探针对即使结合上非目标序列也无法提供信号放大前体序列结合所需要的足够长度，从而防止了对于非特异信号的扩增，保障了特异性。

RNAscope®技术的优势③单分子水平的可视性与量化分析此20x20x20x的引物设计与信号放大原理让单一RNA分子能够在标准的显微镜下以一个点状信号的方式可视化呈现。④能够检测部分降解的RNA得益于其相对短小的目标结合区域(Z形探针对的底端40~50个碱基长度)，此Z形探针对的设计为检测到部分降解的RNA提供了保障。RNAscope原位杂交操作流程步骤1常规固定的细胞或组织石蜡切片;步骤2靶RNA的特异性寡核苷酸探针（Z）对（ZZ）多种RNA目标进行杂交;步骤3多个信号放大分子被杂交，每个识别特定的目标探针，每一个独特的标记探针结合不同的荧光或酶;步骤4显微镜观察结果。操作流程---标准版

1.透化：通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞，以暴露目标RNA。

2.杂交：RNAscope®的20对针对靶基因设计的Z型目标探针与目标RNA杂交。

3.信号放大：RNAscope®检测试剂盒通过信号扩增序列与显色标记有序地互补结合从而扩大信号。

4.可视信号形成：在透视光学显微镜或者多光谱成像系统的观测下，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。

5.量化分析显微镜下直接计数。

原位杂交检测的优点①特异性强，灵敏度高，可有直接法、间接法②具有原位、可见的特点③既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织④所需样本量少、细针穿刺、细胞涂片均可检测⑤应用范围广，定位、定性、定量及亚细胞定位(杂交电镜)⑥双重或多重标记ISH检测技术的应用病毒类:HPV、HBV、HCV、EBER、CMV、HHV8软组织肿瘤①滑膜肉瘤:t(x;18)(p11;q11)SYT-SSX基因融合。②尤文肉瘤:t(11;22)(q24;q12,)EWS-FLI11融合基因，③横纹肌肉瘤:涉及FKHR基因的断裂，④脂肪肉瘤:FUS-CHOP融合基因。ISH检测技术的应用少突胶质瘤:1p/19q杂合性缺失。膀胱癌—CSP3/CSP7;GLPp16/CSP17探针。前列腺癌融合基因探针。宫颈癌—GLPTERC/CSP3探针。慢性粒细胞性白血病—BCR/ABL融合基因探针等。原癌基因:HER2、EGFR、N-myc。

不同病变TPOmRNA的表达（1.结甲;2.桥本氏病;3.腺瘤;4~5.乳头状癌;6.滤泡性癌）Marker123456MarkerRT-PCRβ-actin→TPO←2000←1000←500←250←1002.实时定量PCR数字PCR技术ddPCR技术特点及检测的技术挑战突变检测——从组织到血液SourceofcfDNA--tumornecrosis/apoptosis--tumorexosome/microvesicles

--normaltissueapoptosis--inflammatorycellsTissueBloodctDNA优势指导用药实时监测匀质标本肿瘤组织的异质性可以分为空间上的和时间上的，前者的异质性存在于病灶的不同部位，或者原发灶与转移灶之间，后者的异质性存在于肿瘤本身的进展与治疗的不同阶段。

以血液内ctDNA为检测对象的液态活检可以很好的解决上述难点。

由于肿瘤异质性的特点，病人会随着抗癌药物的使用产生耐药性，二次手术或者活检将更加困难。血液检测作为无法获取组织标本的补充，无创、无损、取样后的检测结果指导临床用药对肿瘤的演化和适性改变进行监控；能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移和复发等方面），并进行个性化的治疗方案指导（如个性化靶向药物用药，个性化化疗等）。ctDNA特点总量少–

<500

DNA拷贝数/200uL血浆片段小–集中在170bp左右FractionofEGFRmutantintotalctDNANumberofEGFRM+plasmasamples61376353activatingmutations,N=32T790M,N=11ctDNA丰度低ctDNA特点决定对检测技术的要求High

sensitivity(0.01%-0.1%)AbsolutequantitationDanymicmonitoring突变丰度肿瘤异质性TKI耐药机制定性到定量、静态到动态检测趋势ctDNA检测技术

373例初治的患者，298例患者存在T790M突变，比例高达约80%；突变丰度<1%的患者比例为98%，突变丰度>1%的患者比例仅为2%；目前，ARMS法的灵敏度为1%，无法检测绝大多数T790M突变；

ARMS

Digital

PCRMasaruetal,ClinCancerRes(2015)ddPCR技术是当前最灵敏的检测手段微滴式数字PCR将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。阴性微滴比例推算起始靶分子的绝对量泊松分布一个待分析的PCR反应体系成千上万个独立的PCR反应体系:靶标分子:有限稀释●:阳性微滴（1）○:阴性微滴（0）泊松分布PCR扩增优点：可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%；缺点：只能检测已知的突变位点，通量低；采用泊松分布推算阳性微滴所占比例一个待分析的PCR反应体系成千上万个独立的PCR反应体系:ddPCR检测流程数据分析原理——泊松分布分析软件根据每个样品中阳性微滴/总微滴的数目计算出靶分子的浓度(copies/uL)现有平台Bio-rad

微滴式数字

PCR

ABIQuantStudio3D芯片数字PCR

12345678←2000←2503.Northernblot4.Southernblot第三节基因重排检测方法基因重排检测的方法主要有两种

Southernblot杂交法多聚酶链反应扩增技术(PCR)FISH方法Southernblot杂交法优点

敏感度高，可靠性好，被视为“金标准”判断是否为单克隆性细胞增生判断肿瘤细胞的来源检测肿瘤细胞的残留和复发缺点

需要较大量的新鲜组织或冰冻组织(10ug)

操作复杂，时间过长需使用放射性同位素标记、易污染，成本高仅适用于科研不适于临床诊断PCR扩增法优点

快速、简便、敏感、经济实用新鲜、冰冻、石蜡包埋组织和穿刺细胞标本均可避免放射性危害，易于常规开展目前IgH基因和TCR和基因用的比较成功缺点

影响因素多稳定性欠佳影响稳定性的因素：样本DNA质量、浓度引物的质量、浓度

PCR反应体系

DNA聚合酶的活性退火温度PCR基因重排检测法

三个基本环节

1模板DNA的制备：提取DNA2PCR扩增

3PCR产物的鉴定

第四节基因突变检测技术

DNA测序(DNAsequencing)作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年Maxam和Gilbert发明了化学降解法。第四节基因突变检测技术PCR-DNA测序法焦磷酸测序法HRM(高分辨熔解曲线)法NGS(下一代基因测序)ARMS法

一、PCR-DNA测序法

确定未知和已知基因突变最直接可靠的方法。双脱氧链终止法是由Sanger等1977年提出。焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析,其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美,而速度却大大的提高。

Sanger法原理（双脱氧链末端终止法）在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）ddX的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接电泳谁终止，碱基就是谁

肺癌的EGFR-21第2573碱基T-G突变2573T>G图一：WildType图二：Mutation图一图二焦磷酸测序焦磷酸测序仪的测序原理主要有四种，即使用合成法测序（SequencingbySynthesis）的454和Solexa，以及使用连接法测序（SequencingbyLigation）的SOLiD和Polonator。该技术是由波尔·尼伦和穆斯塔法·罗纳吉于1996年创立。

HRM和ARMS技术根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测目前开展的基因突变项目肿瘤名称靶分子检测方法大肠癌K-RASB-RAFARMS非小细胞肺癌EGFREML4-ALKARMS胃肠道间质瘤C-KITPDGFRa测序法黑色素瘤B-RAFARMS甲状腺乳头状癌B-RAFARMS病理评估合格的标本适用于EGFR基因突变检测适于突变检测的标本标本通常较大，能提供足够的肿瘤组织用于检测标本可以是冰冻或福尔马林固定组织手术标本标本接收、固定组织处理、石蜡包埋切片及H&E染色组织学观察DNA的质控

突变检测流程检测试剂选用具有SFDA认证的试剂应建立一套完整的试剂进购与质检标准操作规程应在有效期内使用，并有试剂接收，贮存和使用记录。ARMS突变检测实验流程Real-timePCR数据分析（无需PCR后处理）实验结果一目了然配制样品DNA与Taq酶的混合液分装混合液至试剂盒中的八联管稀释DNA样品浓度到2-3ng/ul检测流程的验证应通过验证建立检测所需的最小肿瘤细胞含量和肿瘤细胞数应有病理医生评估整个肿瘤样本的内容，指导有经验的技术员进行操作，必要时进行手工切割进行富集

数据分析和报告内容基因检测报告患者基本信息基因检测结果和结论检测方法和试剂被检标本来源，基本病理学状态；标本种类；肿瘤细胞数量；肿瘤细胞数所占比例等DNA的质控结果由病理医生/主管技师签发！备注：该检测结果仅对本次送检标本负责IonPGM测序平台实验流程步骤时间（h)1DNA/RNA样本--2文库准备3.53测序样本准备34

测序反应25产出数据0.5总计9表1PGM实验流程减少测序反应来源的测序错误，保证长读长序列测序质量，避免GCbias对测序质量的影响无需碱基修饰无需荧光修饰无需酶促级联反应ConfidentialandProprietary—DONOTDUPLICATE

SemiconductorSequencingisbasedonsimple,naturalchemistry（后光学时代测序——基于简单化学反应的半导体测序)数据质量不受读长影响IonPGM™和IonProton™测序原理SensorPlateSiliconSubstrateDrainSourceBulkdNTPTocolumnreceiver∆pH∆Q∆VSensingLayerH+RothbergJ.M.etalNaturedoi:10.1038/nature10242特点:快速直接检测，无需光学转换直接检测氢离子，并将其转换为可由电晶体基片读取出来的电信号

无需激发光源和CCD光学检测设备，仪器维护简单

节约拍照及数据转换时间，测序时间短至1.5hrs82芯片是单次使用耗材，无需后续维护通量可扩展，不同实验设计，可选不同通量芯片，一台机子，契合不同需求，实时开机，无需凑样本IonTorrent™测序系统芯片就是测序仪PGM单端测序读长可至400bp，后期可直接扩展至~600bp，无需硬件升级314™Chip:1.2Mwells,>10Mb316™Chip:6.1Mwells,>100Mb318™Chip:11Mwells,>1.5GbProton单端测序读长可至200bp，:后期可直接扩展至~400bp，无需硬件升级PI™Chip:165Mwells,15Gb83IonPGM测序平台实验流程1.测序文库的构建(IonAmpliseq文库制备)首先准备基因组DNA,然后将DNA随机片段化(消化)成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头(Adaptor)。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。IonPGM测序平台实验流程⑴PCR扩增基因组DNA的目标区域IonPGM测序平台实验流程⑵部分消化引物序列IonPGM测序平台实验流程⑶将接头连接至扩增产物并纯化

⑷纯化未扩增文库。

⑸文库定量和稀释。

⑹储存文库4-8℃1月;-20℃更长时间。IonPGM测序平台实验流程2.自动模本制备(IonPGM200bp)--适用于IonOneTouchTM2系统

在IonOneTouch2仪器上制备模板ISP。需要做的工作如下:⑴准备工作主耍仪器:IonOneTouch2。⑵在IonOneTouch2上制备模板ISP。⑶IonOneTouchTMES的操作及阳性模板富集。IonPGM测序平台实验流程3.IonPGM200bp读长上机测序操作IonPGM测序平台实验流程4.Ampliseq数据分析流程该分析流程基于IonTorrent信息平台TorrentSuite(TS)和IonReporter(IR)两大系统,对Ampliseq数据进行一站式快速分折,包含数据质控、比对、变异位点检出,变异位点注释,以及报告生成等重耍生物信息学分析步骤。TS系统主要负责测序和数据的常规分析,IR系统主要完成对数据的生物学功能注释以及对结果的解读和生成报告。IonPGM测序平台实验流程

NGS应用肿瘤相关的临床检测

1.肿瘤风险预估(肿瘤易感基因检测）早期诊断、分子分型、手术/放化疗(药物疗效评估)、靶向治疗用药靶点检测、预后风险预估、预后监测(复发，转移)和肿瘤相关临床检测特点（需求)。IonAmpliSeq™

BRCA1&BRCA2PanelCustomerperformancewith8samplesonIon316™Chip(average)Meancoverage2,137Minimumcoverage122%amplicons>20%average98.6%amplicons>100X99.81:肿瘤风险预估(1)乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1/2检测根据EuropeanMolecularGeneticsQualityNetwork(EMQN)最佳实践指南对遗传性乳腺癌、卵巢癌的分子遗传分析要求，设计开发分析BRCA1和BRCA2基因编码区域的突变情况。100%覆盖所有编码外显子以及外显子与内含子的边界区域(重叠10~20bp)。167个扩增子，适合于多种样本(如FFPE)，仅需30ng样本DNA。为什么需要测全部外显子：欧美人热点突变≠中国人热点突变大数据时代，数据最是最大资源，全外显子测序提供详尽基因位点信息93(2)抑癌基因TP53全外显子检测覆盖完整TP53编码外显子区域，使用优化引物组，使测序脱靶几率降至最低适用于FFPE样本：125-175bp设计100%覆盖编码区域的设计314/316/318芯片可处理2/10/20个样本与其他基因高度同源，实现高脱靶率设计极具难度,站点中最常申请的基因之一IonAmpliSeq™TP53

Panel94应用2:肿瘤分子分型/靶向用药指导BreastCancerCervicalCancerColorectalCancerLiverCancerLungCancerOvarianCancerPancreaticCancerProstateCancerSkinCancerStomachCancerThyroidCancerALKAKT1BRAFEGFRERBB2KRASNRASMAP2K1PIK3CARETROS1UndefinedFromanatomicaltomolecularapproach肿瘤的分子分型时代已经来临95靶向药物与靶点信息癌症类型突变类型靶向药物非小细胞肺癌EGFRmutationgefitinib,afatinib,erlotinib非小细胞肺癌ALKfusionceritinib,crizotinib非小细胞肺癌ROS1fusioncrizotinib非小细胞肺癌RETfusioncabozantinib非小细胞肺癌METamplificationcrizotinib非小细胞肺癌ERBB2mutationafatinib非小细胞肺癌BRAFmutationdabrafenib,vemurafenib结直肠癌NRASmutationcetuximab,panitumumabcontraindicated结直肠癌KRASmutationcetuximab,panitumumabcontraindicated胃肠道间质肿瘤KITmutationimatinibmesylate胃肠道间质肿瘤PDGFRAmutationdasatinib黑素瘤BRAFmutationdabrafenib,trametinib,vemurafenib胃癌ERBB2amplificationtrastuzumab乳腺癌ERBB2amplificationpertuzumab,trastuzumab96Fusion检测:检测对象及内参(targetsandinternalcontrol)3’Gene5’PartnersVariants(N.)*ALKEML4,HIP1,KIF5B,KLC1,TPR26ROS1CD74,EXR,GOPC,LRIG3,SDC4,SLC34A2,TPM315RETCCDC6,CUX1,KIF5B9NTRK1CEL,NFASC,IRF2BP2,TFG,QSTM1,SSBP2,DYNC2H1,CD74,MPRIP9RNAqualitycontrol(内参):amplificationofhousekeepinggenes(看家基因)MYC,ITGB7,LMNA,HMBS,TBP*>60specificdesignsforcancerrelevantfusionsaccordingtoPubMed针对已报道fusion设计引物97IonAmpliSeq™ComprehensiveCancerPanelv1.0

分析409

个肿瘤基因全外显子区域，约16,000扩增子。一张318芯片检测一个标本。Exon1

Exon2Exon3(3）癌症综合突变：助力肿瘤研究，有的放矢挖掘数据98癌肉瘤全基因组测序：

只列出460个基因，找到6个点突变，4个扩增。收费xxxxx元，耗时18天，未发现靶向药物CDKN2BAmplification(8.52X)CYP2D6Amplification(8.72X)DPYDexon2:c.C85T:p.R29CEPHB1exon8:c.G496A:p.E166KLIMK1exon5:c.C386T:p.S129LMYCAmplification(9.34X)NCAM1exon1:c.1delC:p.Q1fsSOX10Amplification(8.08X)UGT2Bexon5:c.T1172C:p.V391AWEE1exon1:c.A269G:p.E90G其余3.6万个基因，均无发现实体瘤变异图谱DataanalysisperformedusingtheOncomineKnowledgebase(4)肿瘤突变和治疗方案的关联性证据肿瘤指示肿瘤突变用药指导FDAApprovedLabelsBreastCancerERBB2amplificationPertuzumab（帕妥珠单抗）,trastuzumab（曲妥单抗）ColorectalCancerKRASmutationCetuximab(西妥昔单抗),panitumumabcontraindicated(帕尼单抗)GastricCancerERBB2amplificationtrastuzumab（曲妥单抗）MelanomaBRAFmutationDabrafenib(达拉非尼),trametinib(曲美替尼),vemurafenib(威罗菲尼片)Non-SmallCellLungCancerALKfusionCeritinib(色瑞替尼),crizotinib(克唑替尼)Non-SmallCellLungCancerEGFRmutationAfatinib(阿法替尼),erlotinib(厄洛替尼)NCCNGuidelinesGastrointestinalStromalTumorPDGFRAmutationDasatinib(达沙替尼)ColorectalCancerNRASmutationcetuximab(西妥昔单抗),panitumumabcontraindicated(帕尼单抗)MelanomaKITmutationimatinib(伊马替尼)mesylateNon-SmallCellLungCancerBRAFmutationdabrafenib(达拉非尼),,vemurafenib(威罗菲尼片)Non-SmallCellLungCancerERBB2mutationafatinib(阿法替尼)Non-SmallCellLungCancerMETamplificationCrizotinib(克挫替尼）Non-SmallCellLungCancerRETfusionCabozantinib（卡博替尼）Non-SmallCellLungCancerROS1fusioncrizotinib(克挫替尼）12种不同的肿瘤突变和14种FDA审批的治疗药物相关101客户定制：肿瘤化疗敏感性基因检测及药物指导panel

3:肿瘤化疗药物毒性检测1024:基于ctDNA&CTC的无创肿瘤检测(液体活检)ctDNA，即无细胞循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA）。指原发癌中细胞凋亡和坏死后，肿瘤DNA降解并释放进循环血液中，游离于细胞外的小片段核酸；CTC，即循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell)，指从原发肿瘤脱落在血循环液中的一些完整细胞，其可能促成了转移，在外周血中CTC的数量极少（约1个CTC/107白细胞/ml血液）。早发现:可用于早期无创检测和监控癌症病人的状态；

用药指导及耐药性追踪:无创检测是否适用某种靶向药物，及追踪是否发生靶向治疗的耐药突变，时时调整治疗策略；预后监测:癌症病人无创愈后监测，看治疗后疾病是否复发，转移。CynvenioLiquidBiopsyTM系统结合cancerhotspotpanel：

实现无创液体活检104~294,000primerpairsacross12primerpools

>24,500-plexPCR!每个96孔板可以做8个外显子样本!起始低至50nggDNA覆盖了>97%CCDS数据库内的信息(Release12)>19,000codinggenes,>198,000codingexons,noUTRs,miRNAs,orncRNAs~85%人类疾病相关的突变都是在编码区或剪接区域Ampliconsizerange225-275bp

Averageinsertsizeis~202bp2-3个样本/P1chip5:肿瘤样本全外显子测序IonAmpliSeq™Exome1056：肿瘤全基因组差异表达检测适用人全基因组表达分析全面覆盖RefSeq-20,802genes单管PCR/sampleFFPE样本适用，低至10ngtotalRNA起始无需纯化mRNA或去除rRNA~110bpaverageinsertsize(~150bpampliconsize)IonSuite友好界面数据分析插件Proton：8samples/P1chipIonAmpliSeq™Transcriptome106

环境质控

操作环境的质控千万要警惕气溶胶的污染：指数级增长2n划分区域，注意风向减少开盖，定期紫外照射选择污染几率小的方法实验室的布局质量手册、管理程序文件、操作程序文件、作业指导书、记录表格等对实验室的要求：订购质量运输接收验货/质检记录（批号/有效期）储存（冰箱位置）销毁记录（批号/操作者/日期）检测（本批号）DNA抽提/定量操作规范PCR上样、上机及对照设立操作规范阳性和阴性对照记录（检测日期/标本号/操作者）储存（冰箱位置）良好的室内外质控室获得准确结果的保证内部质控实验室内部功能分区标准化操作流程（sop）内部质控体系实验人员上岗培训外部质控、卫生部国家病理质控中心（PQCC)实验室室间比对长海医院欧洲分子遗传检测质控网（EMQN）外部评价计划EGFR突变检测证书院内规范的标本送检流程标本检测规范流程同意开展新项目临床相关科室支持临床基因扩增实验室认证

实验操作人员应具有PCR实验室上岗证结果和报告审核人员院方支持实验室认证实验人员检测SOP流程

分子检测建设的步骤DNA测序的质量控制DNA测序的标准体系建立各种方法间的相互印证实验室间的相互印证对照体系的设置第五节基因多态性及其检测人类基因组是一个结构十分稳定的系统，不同民族和群体有着相同的染色体数目和基因分布，核苷酸序列也基本相同。在整个进化过程中，DNA序列也在不断地发生变异，有的变异是有益的、或有害的、或不产生表型(中性)。这些变异中的一部分被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的多态性。一DNA多态

DNA多态（DNAPolymorphism）：

群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。二、微卫星不稳定性分析

微卫星不稳定性基于数量可变的串联重复序列(VNTR)的发现，一般将60bp～70bp的串联重复称为小卫星DNA,又称VNTR,1bp～4bp的串联重复称为微卫星DNA(简单重复序列),具有丰富的多态性,高度杂合性、重组率低的特点，可作为DNA的多态性标记，微卫星不稳定性是指简单重复序列的增加或丢失。

通过合成特异位点的PCR序列，经扩增后凝胶分析或测序仪分析，检测其不稳定性。应用最多的为DNA错配修复基因的检测。微卫星位点的杂合性缺失

AB胰腺癌组织中微卫星位点的杂合性缺失。A为正常对照，B为肿瘤组织，箭头所指为杂合性缺失条带。三、单核苷酸多态性分析-SNP

SNP是在人类基因组研究基础上发展的第三代多态性标记。估计在人类基因组中约有900万个SNP位点，可用于易感基因检测、复杂疾病的基因定位、疾病关联分析、分子遗传学、药物设计及法医学等领域。传统检测方法:特定位点引物合成、PCR扩增后凝胶电泳或测序仪分析。存在问题:位点的选择、特异性等。基因芯片的技术:

胰腺癌中SNP位点的多态性检测NT胰腺癌中SNP位点的多态性。N为正常组织，T为肿瘤组织，箭头所指的泳动变位条带即为多态性位点。第六节染色体易位及其检测技术染色体易位是指细胞核内两条非同源染色体各发生一处断裂，并交换其无着丝粒节段，形成两个融合后的新染色体的过程。染色体易位的检测

RT-PCR的方法检测染色体易位融合基因的转录产物mRNA.原位杂交(FISH、C