植物细胞工程及其应用

其次章细胞工程其次章细胞工程【学问目标】①了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。②学习进行动植物细胞及组织的培育方法。③相识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。④驾驭利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。⑤领悟干细胞芯康脑砗凸饷髑熬啊第三章细胞工程【技能目标】①学会描述植物组织培育、原生质体融合、动物细胞组织培育及细胞融合的基本过程。②驾驭植物组织培育及快速繁殖的方法。第一节细胞工程概述一、细胞工程的基本概念细胞工程就是在细胞水平探讨、开发和利用各类细胞的工程。细胞工程是一种细胞水平上的遗传工程第一节细胞工程概述二、细胞工程基础学问细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。原核细胞如：细菌、放线菌等。真核细胞如：酵母、动植物等。原核细胞生长快速，无蛋白质结合的DNA易于人们进行遗传操作，是细胞改造的良好材料。第一节细胞工程概述三、细胞工程基本技术（一）无菌操作技术试验操作应在无菌室内进行无菌室要求留意四周环境的卫生整齐超净工作台是最基本的试验设备对生物材料进行彻底的消毒和除菌是试验成功的前提第一节细胞工程概述三、细胞工程基本技术（二）细胞培育技术细胞培育是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长细胞培育步骤为：取材和除菌；配制细胞培育基，并对培育基进行灭菌或除菌；培育室培育第一节细胞工程概述三、细胞工程基本技术（三）

细胞融合技术1.制备原生质体2.诱导细胞融合3.筛选杂合细胞其次节植物细胞工程及其应用一、植物组织培育（一）预备阶段1.选择合适的外植体①大小要适宜。②同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化实力、分化条件及分化类型有相当大的差别。③植物胚与幼龄组织器官比会化组织、器官更简洁去分化，产生大量的愈伤组织。④不同物种相同部位的外植体其细胞分化实力可能大不一样。其次节植物细胞工程及其应用一、植物组织培育2.外植体的消毒灭菌外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。其次节植物细胞工程及其应用一、植物组织培育3.配制适宜的培育基

组织培育基通常都包括三大类组分：①含量丰富的基本成分如蔗糖或葡萄糖高达每升30克，以及氮、磷、钾、镁等；②微量的无机物，如：铁、锰、硼酸等；③微量有机物，如激烈素、吲哚乙酸、肌醇等。各培育基中，吲哚乙酸和激烈素的变动幅度很大，这主要因培育目的而异。其次节植物细胞工程及其应用一、植物组织培育（二）诱导去分化阶段器官切段去分化，培育基中应添加较高浓度的生长素类激素诱导外植体去分化可以接受固体培育基，在培育室中多层培育外植体表面除菌后，切成小片（段）插入或贴放培育基表面即可通常把它们置于人工照明条件下培育，以期得到绿色愈伤组织。其次节植物细胞工程及其应用一、植物组织培育（三）继代增殖阶段愈伤组织长出后经过4~6周后（四）生根成芽阶段胚状体光照是本阶段的必备外因（五）移栽成活阶段其次节植物细胞工程及其应用二、植物细胞培育和次生代谢物的生产（一）悬浮细胞培育系统其次节植物细胞工程及其应用二、植物细胞培育和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培育系统1.平床培育系统其次节植物细胞工程及其应用二、植物细胞培育和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培育系统2.立柱培育系统其次节植物细胞工程及其应用二、植物细胞培育和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培育系统2.立柱培育系统①要选用高产细胞株系。②在养分液中加入目的产物的干脆或近干脆前体物质，往往对增产目的产物有特效。③对各类细胞的培育都应反复摸索碳源、氮源和生长调整物质的配比，找出最佳方案。④适量光照及通气在多数状况下有利于产物的生成。其次节植物细胞工程及其应用二、植物细胞培育和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培育系统以下简要介绍褐藻酸钙固定植物细胞的技术路途：其次节植物细胞工程及其应用三、植物细胞原生质体制备与融合（一）原生质体的制备1.取材与除菌2.酶解3.分别4.洗涤5.鉴定其次节植物细胞工程及其应用三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合1.化学法诱导融合聚乙二醇（PEG）结合高钙高PH诱导融合法2.物理法诱导融合平行电极法其次节植物细胞工程及其应用三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合融合处理后再生的细胞株将可能的类型：①完全的杂合植株②核质异源的植株③融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分裂生长成嵌合植株。其次节植物细胞工程及其应用三、植物细胞原生质体制制备与融合（三）杂合体的鉴别与筛选1.杂合细胞的显微镜鉴别2.互补法筛选杂合细胞3.接受细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体4.依据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别其次节植物细胞工程及其应用四、单倍体植物诱发与利用（一）花药培育1.选取成熟度适中的花蕾或幼穗2.花药预处理3.选择适当的培育基与培育条件（二）花粉培育培育单倍体植株其次节植物细胞工程及其应用四、单倍体植物诱发与利用（三）未授粉子房或胚珠的培育充溢希望的发展方向（四）杂交法获单倍体植株（五）单倍体培育物的加倍可用0.2%~0.4%秋水仙素处理24~48h其次节植物细胞工程及其应用五、人工种子的研制（一）人工种子的构成及特点1.人工种皮2.人工胚乳3.胚状体其次节植物细胞工程及其应用五、人工种子的研制突出的优点：①可以不受环境因素制约②有利于保存该种系的优良性状；③成本更低，更适合于机械化田间播种；④可依据须要在人工胚乳中添加适量的养分物、激素、农药、抗生素、除草剂等其次节植物细胞工程及其应用五、人工种子的研制（二）人工种子的制备1.胚状体的制备及其同步生长（1）低温法：（2）抑制剂法：（3）分别法：（4）通气法：（5）渗透压法：2.人工胚乳的制备

MS(或SH、White)培育基＋马铃薯淀粉水解物（1.5%）；SH培育基（1∕2浓度）＋麦芽糖（1.5%）3.配制包埋剂及包埋褐藻酸钠人工种子包埋示意图其次节植物细胞工程及其应用五、人工种子的研制（三）人工种子的贮存与萌发迄今为止尚未攻克的难关。一般将人工种子保存在低温（4~7℃）和干燥（相对湿度小于67%）条件下其次节植物细胞工程及其应用六、植物脱病毒技术（一）植物脱病毒途径1.物理学方法2.化学方法3.生物学方法基本流程4.综合脱毒法其次节植物细胞工程及其应用六、植物脱病毒技术（二）植物脱毒检测1.外形视察法2.电镜视察法3.免疫血清法第三节动物细胞工程及其应用一、动物细胞培育动物细胞工程从细胞生物学和分子生物学的层次，依据人类的须要，一方面深人探究、改造生物遗传种性，另一方面应用工程技术的手段，大量培育细胞、组织或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物第三节动物细胞工程及其应用二、动物细胞组织培育（一）细胞培育法培育动物细胞一般步骤：①无菌取出目的细胞所在组织，以培育液漂洗干净。②以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。③将小组织块置解离液离散细胞（解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子）。④低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移至培育瓶培育。第三节动物细胞工程及其应用二、动物细胞组织培育1.微导管培育法第三节动物细胞工程及其应用二、动物细胞组织培育2.微载体培育法（3）微胶囊培育法第三节动物细胞工程及其应用二、动物细胞组织培育（二）组织培育法①无菌操作取出目的组织，以培育液漂洗。②以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成1~2mm2小块，移人培育瓶。③加人合适的培育基浸润组织,当心地将培育瓶平翻180°，搁置15~30min，以利组织块的贴壁生长。④翻回培育瓶，平卧静置于37℃培育。第三节动物细胞工程及其应用二、动物细胞组织培育（三）培育物的传代（四）无血清培育三大部分：①基础培育基②基质因子③生长因子、激素和维生素第三节动物细胞工程及其应用二、动物细胞组织培育（五）培育物的长期保存经典传代法冷冻保存法液氮保存法为：①将成熟培育物（细胞）与5％~10％的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓯瓶中；②缓慢降温（每分钟1~3℃）至一30℃；③接着降温（每分钟15~30℃／min）至一150℃；④转移至液氮冻存,可无限期保存。(六)细胞组织培育污染的防治第三节动物细胞工程及其应用三、动物细胞融合（一）病毒诱导融合（二）化学诱导融合PEG诱导融合（三）电激诱导融合第三节动物细胞工程及其应用四、单克隆抗体生产技术第三节动物细胞工程及其应用五、细胞核移植与动物克隆（一）核移植1.异种核质关系探讨2.脊椎动物克隆——细胞核遗传全能性探讨第三节动物细胞工程及其应用五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆“多莉”绵羊是如何克隆诞生的呢？第三节动物细胞工程及其应用五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆意义①遗传素养完全一样的克隆动物将更有利于开展对动物（人）生长、发育、苍老和健康等机理的探讨。②有利于大量培育品质优良的家畜。③经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类供应源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官。④科学家将很快地从目前的同种克隆技术推动到异种克隆第三节动物细胞工程及其应用六、染色体转移（一）微细胞介导法图供体细胞→秋水仙素处理→低温处理→细胞裂开→高速离心→收集染色体第三节动物细胞工程及其应用六、染色体转移①干脆用微注射针向胞内注射染色体悬液。②将染色体与细胞共培育，染色体被细胞以胞吞的方式摄入。本法转移成功率低。③将染色体与高浓度CaCl2混匀后滴加到受体细胞上，可提高成功率。④用卵磷脂与胆固醇混合液制成脂质体，将染色体包袱其中，再经聚乙二醇与受体细胞融合，达到转移染色体的目的。第三节动物细胞工程及其应用七、干细胞探讨干细胞（stemcell）是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或苍老组织、器官功能的志向种子细胞。第三节动物细胞工程及其应用七、干细胞探讨三种类型：①全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞②多能性干细胞，发育潜能受到确定的限制。如：骨髓造血干细胞可分化成为至少12种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。③专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能亲密相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞和肌肉中的成肌细胞等。第三节动物细胞工程及其应用七、干细胞探讨干细胞具有以下显著的特点：具有分裂成其他细胞的可能性；具有无限增殖分裂的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。第三节动物细胞工程及其应用七、干细胞探讨三个阶段：①获得干细胞系②建立干细胞诱导分化模型③将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。第三节动物细胞工程及其应用七、干细胞探讨优点：①低毒性（或无毒性），一次治疗有效；②不须要完全了解疾病发病的精确机制；③用于自身干细胞移植，可避开产生免疫排斥反应。第四节微生物细胞工程一、原核细胞的原生质体融合G+：①分别培育带遗传标记的双亲本菌株至指数生长中期②分别离心收集菌体，以高渗培育基制成菌悬液③混合双亲本，加入适量溶菌酶，作用20~30min；④高速离心后去上清液得原生质体，用少量高渗培育基制成菌悬液；⑤加入10倍体积的聚乙二醇（40%）促使原生质体凝集、融合；⑥数分钟后，加入适量高渗培育基稀释；⑦涂接于高渗选择培育基上进行筛选。第四节微生物细胞工程一、原核细胞的原生质体融合对G+而言，在加入溶菌酶数分钟后，应添加少量0.1mol／L的EDTA·Na2共同作用15~20min，则可使90%以上的革兰氏阴性细菌转变为可供细胞融合用的球状体。第四节微生物细胞工程二、真菌的原生质体融合真菌原生质体融合的要点以聚乙二醇为融合剂，在特异的选择培育基上筛选融合子。只有那些形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代。具有杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳定，需经多代考证和鉴定才能最终断定是否为真正的杂合细胞。不少大型食用菌，如蘑菇、香菇、木耳、凤尾菇和平菇等经细胞融合获得一些新的性状，取得了相当可观的经济效益。福建省轻工业探讨所通过细胞融合获得了耐高温等性状的蘑菇新品种。植物组织培育一、试验目的了解离体无菌培育对试验材料消毒、接种的要求，初步驾驭取材、培育材料灭菌和接种等操作技术。植物组织培育二、试验原理植物组织培育的理论依据是植物细胞具有全能性。即使是已经高度成熟和分化的细胞，也保持着复原到分生状态的实力。植物细胞表现出全能性的条件是脱离母体并具有合适的生长条件。植物离体培育所需的养分是由培育基来供应的。在植物细胞脱分化和再分化的过程中，植物激素的调控至关重要。生长素和细胞分裂素的浓度和比例是限制植物离体培育细胞生长模式和器官发生的最重要的手段。植物组织培育三、试