植物细胞工程知识点

绪论：细胞工程(cellengineering)：应用细胞生物学和分子生物学方法， 借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上争论改造生物遗传特性和生物学特性， 以获得特定的细胞， 细胞产品或生物体的有关理论和技术方法的学科； 广义：全部的生物组织， 器官及细胞离体操作和培育技术；狭义：细胞融合和细胞培育技术；细胞学说：细胞是生物构造，功能和发育的根本单位；1902，Haberlandt 《植物细胞离体培育试验》 ；B族维生素的应用： White 等；兴奋素的觉察：Miller；单个胡萝卜细胞形成体细胞胚： 1958，Steward；最早争论茎尖培育人参：罗士韦；植物细胞工程技术在育种上的应用〔简答〕 ：1，快速获得特别倍性材料：单倍体，三倍体2，抑制远缘杂交不亲和性 3，抑制杂种胚早期夭折 4，导入外源基因 5，突变体选择 6，种质资源储存植物胚胎干细胞： 茎端分生细胞，形成层分生细胞和薄壁细胞； 组织干细胞： 分化程度高的一些细胞； 脱分化〔dedifferentiation): 分化细胞转变为分生状态，形成胚性细胞团或愈伤组织的现象； 脱分化条件： 创伤和外源激素第一章：分化〔differentiation导致细胞形成不同构造，引起功能转变或潜在发育方式转变的过程；脱分化〔dedifferentiation):培育条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程；再分化〔redifferentiation离体条件下，细胞脱分化后，无序生长的细胞及其愈伤组织重进入有序生长再生为个体的过程细胞全能性〔celltotipotenc：全能性差异：植物顶端分生组织细胞较强；完全失去分裂才能的细胞，如细胞核开头解体的筛管和木质部局部没有；细胞脱分化过程中的生理活动与细胞构造变化： 1，细胞质显著变浓，大液泡消逝；2，核体积增加并逐步移位至细胞中心 3，细胞器增加 4，其中细胞脱分化的重要特点：液泡蛋白体的显现，质体转变为原质体 5，细胞开头脱分化的标志：蛋白体的显现，同时细胞质密度增加；〔填空〕极性〔 polarity〕是植物细胞分化中一个根本现象；细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志；极性生长的重要缘由是细胞内不同方向 Ca+梯度分布；植物细胞离体培育再生两条途径是器官发生体和细胞胚胎发生离体培育中器官发生的方式： 1，先芽后根，较为普遍； 2，先根后芽； 3，愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株；激素对器官分化的调控： IAA与KT 比例高时利于根的形成，低时利于芽的形成；植物多肽PSK可极大加强根本激素的作用成效；体细胞胚的形成： 1，从外植体上直接发生； 2，经过愈伤组织：诱导形成愈伤组织；胚性化；体细胞胚形成；高浓度 2,4-D可诱导愈伤组织产生；转到低浓度使胚性化； 3，细胞悬浮培育的体细胞胚发生；胚性细胞团：成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞；体细胞胚与合子胚的不同： 1，合子胚发育初期有明显的胚柄，体细胞胚只有类似胚柄的构造；2，子叶不标准； 3，体积小； 4，干物质含量低； 5，含水量高； 6，没有休眠其次章：16体细胞无性系变异〔 Somaclonalvariation：经过组织培育循环显现的再生植株变异组织培育是诱导的主要缘由； 1，体细胞再生植株的变异； 2，花粉植株的无性系变异诱变方式：体细胞人工突变，基因转移，体细胞融合，物理诱变〔紫外线， X 射线等〕和化学诱变〔DES，EMS等〕嵌合体(mosaic)：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞体细胞无性系变异的特点〔简答〕 ：1，体细胞无性系变异是组培中较普遍现象 2，体细胞无性系变异可遗传 3，体细胞无性系变异频率显著高于自然突变 4，体细胞无性系变异与外植体来源及培育时间有关〔填空〕分化水平高的组织产生的无性系比分生组织产生的更易变异；获得较高频率的体细胞无性系变异：以分化程度高的组织或细胞为外植体，在确定植物激素浓度下诱导愈伤，并经较长时间的继代培育，然后诱导分化再生植株，有可能得到较高频率的体细胞无性系变异；体细胞变异的细胞遗传学根底〔论述〕 ：染色体变异： 非整倍体；染色体断裂，缺失，易位，基因重复和突变植物组织和细胞进入离体培育环境后，细胞分裂的不规章性显著增加，导致染色体和分子水平的变异；最常见是染色体数目变化；离体培育细胞染色体易于断裂缘由： 细胞离体培育时分裂周期缩短，分裂速度加快，异染色质复制落后于真染色质，形成染色体桥，造成染色体断裂；离体培育细胞反常有丝分裂类型：1，有丝分裂失败或进展无丝分裂2，核内有丝分裂：染色体复制而细胞不分裂3，核内再复制：DNA复制而染色体不复制4，有丝分裂时形成多极纺锤体；转座子活化的影响： 1，转座子活化可造成基因表达的广泛变化， 因此无性系变异频率才如此之高 2，转座子具有使不活动的构造基因活化特点，因此会有显性基因 3，转座子仍可使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化，提高基因表达的强度，即基因放大；单倍体培育细胞的无性系变异选择抗性突变细胞株具有高效和简洁稳固优越性： 隐性突变基因可以表达， 大大提高选出抗性细胞株的机率； 显著加快了突变体的稳固和纯合过程；第三章：器皿的选择与清洗： 不同规格三角瓶；清洗：自来水洗，烘干，泡酸，自来水洗，去离子水洗，三蒸水洗，烘干〔培育材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗；酸液〔洗液〕 ：浓硫酸加重铬酸钾〕母液的配制： 1，大量元素母液：通常配成 10×浓缩液，配 1L培育基时加 100mL留意：配制时加一个溶解一个，最终加钙 2，微量元素母液：通常配成 1000×浓缩液，配 1L培育基时加 1mL3，铁盐母液：通常配成 100×浓缩液，配 1L培育基时加 10mL，螯合铁使得培育基pH上升至 6～8时，铁离子仍保持二价，可被很好地吸取利用过滤消毒方式： 0.45或m微孔滤膜进展过滤，如激素，诱导子等复合灭菌：在充分清洗后〔通常流水冲洗几小时〕 ，75％酒精灭菌 ，0.1%升汞灭菌 5～20min，消毒剂灭菌后确定要用无菌水充分清洗灭菌方式：1，高压灭菌 2，干热灭菌 3，过滤灭菌 4，药剂灭菌 5，火焰灭菌 6，熏蒸灭菌：KMnO4+HCHO 试验室灭菌 7，紫外灭菌：无菌间及安全柜灭菌激素〔脱落酸〕：组培中主要用于胚胎或胚状体发育的后期，抑制胚胎的过早萌发，促进胚胎成熟，使胚胎长成外形正常的植株26生长素分裂素使用原就： 较高浓度的生长素单独或与细胞分裂素结合使用可有效刺激培育细胞的增殖和连续生长，形成愈伤组织；培育基中 KT浓度高于 IAA 浓度时，培育物形成芽，不形成根；两者浓度大致相等时，只诱导愈伤组织发生，根本没有器官发生；当 IAA 浓度高于KT时，培育物分化出根，不形成芽；体细胞胚胎发生〔 somaticembryogenesi) 从植物体细胞培育物中分化胚胎或胚状体过程；第四章快繁〔rapidpropagation〕或微繁〔micropropagation〕技术：利用组培进展快速养分生殖的技术快繁的应用价值： 1，杂合植物材料的大量繁衍； 2，脱毒种苗生产 3，加速繁衍数量有限的特别种质材料 4，单独繁衍雄株或雌株外植体褐变 brooming：褐变缘由 :植物中含有多酚，创伤会激活多酚氧化酶，将多酚氧化为棕褐色的醌类， 使得外植体切口发生褐变， 并渗透入培育基， 严峻影响培育物的生长和分化，甚至致其死亡； 影响褐变因素： 木本植物外植体易褐化，特别成年树；培育基中过高浓度的无机盐和肌醇会加剧褐变； 6-BA和KT 有诱导褐化作用；强光和高温会促进褐化； 预防褐变：1，选取酚类含量低的试验材料 2，选择无机盐含量低，不加肌醇的培育基 3，在弱光线或黑暗条件下培育 4，培育基中参加抗氧化剂： Vc，柠檬酸，半胱氨酸，二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮〔 PVP)；5，在培育基中参加 0.5%~1%活性炭，吸附醌类，留意同时提高培育基中激素浓度； 6，不断地更换培育基再生植株方式： 1，外植体直接产生不定芽 2，外植体产生愈伤，转移培育后产生胚状体，再生植株 3，外植体产生愈伤，转移培育后分化芽，再生植株；不定芽 adventiousshot 顶芽和腋芽以外任何其它器官或组织产生的芽组培脱毒方法： 1，高温脱毒：病毒和植物细胞对高温耐受力不同；热处理脱毒又称为温热疗法，分温汤浸渍处理和热风处理两种； 2，低温脱毒也称冷冻法 3，化学法： 2-硫尿嘧啶，8-氮鸟嘌呤， virazole〔病毒唑〕和一些蛋白质与核酸合成的抑制剂，植物病毒鉴定方法： 1，指示植物法 2，抗血清鉴定法 3，酶联免疫法 4，电镜检查法 5，RT-PCR〔填空〕1，朱至清觉察低铵离子浓度和过滤消毒的单糖显著促进禾谷类花粉胚的发育，建立了N6 和改进 N6培育基 2，欧阳俊闻确立单核中期的小麦花粉最适于产生花粉植株，较高的培育温度有利于花粉绿苗形成 3，卫志明首次指出大麦患病碳饥饿可大幅度提高花粉胚的产率；4，孙敬三觉察花粉中质体 DNA 降解引起的质体 RNA和蛋白质的匮乏是白化苗形成的缘由；5，烟草“单育一号”成花 水稻“单丰一号”；单核中晚期至双核早期的花粉最易形粉胚或花粉愈伤条件培育基： 已经预先培育过花药〔或其它离体细胞〕的液体培育基游离小孢子培育〔 isolatedmicrosporecultur，又花粉培育〔 pollenculture：把小子从花药中分别出来，进展人工培育小孢子分别培育方法： 挤压法，散落法和器械法单倍体植株： 植物学上通常把具有配子体染色体数目的孢子体叫做单倍体植株单倍体植物在遗传育种上的价值〔简答〕 ：1，利用单倍体植物把握杂种分别，加快常规育种速度 2，提高常规育种的选择效率 3，利用 H系进展基因定位，绘制遗传图心形胚以后的双子叶胚较易培育，球形胚很难培育； ABA 可抑制幼胚吸水，使其脱水枯燥，发育成熟胚胎挽救：种间或属间杂交时，两个基因组表达不和谐，多数情形下胚乳最先败育，胚仍36然安康，可通过离体胚培育将杂种幼胚培育成植株，称为胚胎挽救胚乳培育的意义： 1，胚乳细胞中储存大量淀粉，蛋白质和脂类，是争论这些产物代谢工程的抱负系统 2，完全由薄壁细胞组成的均质组织，是试验外形发生学争论的极好材料； 3，胚乳植株－三倍体，高产，优质，果实无籽；三倍体的经济价值：无籽果实；生物量高；品质好；获得三体以进展基因定位；第五章悬浮培育 Cellsuspensionculture:将单个游离细胞或小细胞团在液体培育基中进展培育增殖的技术悬浮细胞系： 1，悬浮培育物分散性良好，细胞团较小； 2，均一性好：细胞外形和细胞团大小大致一样； 3，生长快速悬浮培育细胞的同步化： 1，分选法：梯度离心； Ficoll；流式细胞仪 2，饥饿法 3，抑制剂法 FdU，HU4，低温处理：低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的培育温度，也可到达局部同步化；看护培育〔nurseculture)：在固体培育基上置入一块活泼的愈伤组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸润湿后将细胞接种于滤纸上， 当培育细胞长出微小细胞团以后， 将其肢解转至琼脂培育基上让其快速生长次生代谢产物 secondarymotabalate：由初生代谢产物经过一些特别的代谢途径派生出来的小分子化合物意义：植物次生代谢产物始终是药物和工业原料的重要来源；在保持植物抗逆性，抗病性和抗虫性及担当信号分子方面起重要作用；植物细胞培育的优势： 可摆脱对植物资源的依靠，疼惜物种多样性和生态环境药用植物细胞培育步骤： 1，诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系 2，选择高产细胞系 3，生物反响器中大量培育细胞或细胞团二步法培育： 第一步，愈伤培育在生长培育基上使细胞快速增殖；其次步，细胞生长通过指数生长期后，转移到生产培育基上进展其次步培育，以获得最高次生产物产量；诱导子〔elicitor)：一类能引起植物细胞代谢强度转变或代谢途径转变的物质，主要指生物来源的化合物，如寡糖，多糖等；第六章原生质体〔protoplas：植物细胞中，除细胞壁以外的成分分别原生质体的方法： 1，机械法：叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞发生质壁分别，原生质体收缩成球形，完全脱离细胞壁；剪碎组织，可释放原生质体；缺点：产量低，无法从分生组织分别原生质体； 2，酶法双子叶植物的幼叶， 子叶，根和下胚轴的切段通常被用来制备原生质体；禾谷类植物， 疏松易碎的愈伤或悬浮培育的细胞是制备原生质体的抱负材料酶溶液的配制：为保持释放出的原生质体的活力和膜稳固性， 要求酶液满足以下条件：1，酶液渗透压必需与处理细胞的渗透压相像：同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透压最高， 愈伤次之，胚性悬浮细胞要求最低； 可用原生质体培育基做溶剂，其渗透压适宜； 2，酶液添加 CaCl2· 2H2O,KH2PO4 和葡聚糖硫酸钾以提高原生质体膜的稳固性；仍可参加 AgNO3 削减酶解产生的乙烯，参加过氧化物歧化酶减轻O2自由基对细胞膜损耗，从而提高原生质体植板率； 3，MES〔吗啉乙基磺酸〕作pH缓冲调剂剂对于保持酶解物的酸碱环境起缓冲作用，增加原生质体的释放量和稳固性；4，酶溶液最适 pH范畴为 酶液配好后，过滤灭菌备用；46原生质体活力检测方法〔FDA〔Fluoresceindiacetate，荧光素双醋酸盐〕活体染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解为不能排出的，累积在质膜内的荧光素；在荧光显微镜下观看时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体植物细胞的离体受精过程： 1，精细胞分别： 三细胞花粉：禾本科与十字花科植物，花粉中含有一个养分细胞和两个游离在养分细胞的细胞质中的精细胞，为三细胞花粉；二细胞花粉：茄科和百合科植物， 花粉中有一个养分细胞和一个生殖细胞， 为二细胞花粉；花粉萌发后，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子；三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分别精子； 二细胞花粉，需要先进展花粉的离体培育，待精子形成后，再从花粉管中分别精子； 2，三细胞花粉 精细胞分别方法 ：渗透压冲击法：花粉置于低渗溶液中，吸水裂开，释放出精细胞；经低速离心，得到精细胞；研磨法：成熟花粉悬浮于适当溶液中，研磨使花粉裂开，释放精细胞；二细胞花粉花粉精细胞分别方法：离体培育法：花粉在液体培育基中人工萌发， 待形成精细胞后， 用渗透压冲击或研磨使花粉管裂开；活体－离体法： 先将花粉授在柱头上，花粉萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分离；改进的活体－离体法； 3，卵细胞的分别： 可先分别胚囊，从中分别卵细胞也可直接从胚珠中分别卵细胞： 胚囊分别技术－酶解振荡法； 生活胚囊的分别方法： 胚珠放在酶液中，酶液：纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶，蜗牛酶或崩溃酶；酶解－渗透压冲击法4，卵细胞与胚囊其它细胞的分别： 酶解－解剖法：优点：分别率较高；缺点：酶解如过度或清洗不完全，会对后期合子培育产生不利影响；第七章体细胞杂交〔 somatichybridization〕：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法；又称原生质体融合〔 protoplastfusio：指将植物不同种，属，甚至科间的原生质体通人工方法诱导融合，然后进展离体培育，使其再生杂种植株的技术；胞质杂种〔cybrid：种1974，Kao建立 PEG法异核体〔hetrokaryo：不同来源原生质体融合形成的杂种原生质体；原生质体融合种类： 1，对称融合 2，非对称融合原生质体融合手段： 1，自发融合 2，诱发融合