微生物学第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章

微生物的纯培养和显微技术培养物（culture）：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体。纯培养物（pureculture）：只有一种微生物的培养物。纯培养：把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的技术，是进行微生物学研究的基础。显微技术：是进行显微观察时，显微镜的使用技术、标本制作技术、观察技术及生物体组成成分定性和定量分析技术。一、微生物的分离和纯培养二、显微镜和显微技术三、微生物形态1一、微生物的分离和纯培养1.无菌技术（aseptictechnique）：微生物的研究及应用中，在分离、转接及培养纯培养物时，防止被其它微生物污染的技术。（1）微生物培养基及常用器皿的灭菌常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌和干热空气灭菌。

（2）无菌操作，接种操作：用接种环或接种针，在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器。2.用固体培养基分离纯培养物

培养基（culturemedium）：人工配制的、适合不同生物生长繁殖、积累代谢产物的营养基质及条件。

菌落（colony）：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞生长群体。如众多菌落连成一片，便成为菌苔（lawn）。2

培养平板（cultureplate，也称平板或平皿）：溶化的培养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。

（1）涂布平板法（Spreadplatemethod）适于大多数好氧微生物。3（2）稀释倒平皿法（Pourplatemethod）1.dilutesample1ml9ml10

10010001041051061072.plateout0.1ml

4

（3）平板划线法（Streakplatemethod）适于大多数非蔓延性的微生物。5

（4）稀释摇管法（dilutionshakeculturemethod）不常用，适于厌氧微生物的分离。

3.单细胞或单孢子分离在显微镜下或显微操纵仪下，用毛吸管或机械手选取单个细胞或单孢子。64.用液体培养基分离纯培养物主要采用稀释法，适于许多原生动物及藻类。5.选择培养分离设计特定的环境条件，使之适合所需微生物的生长，从而使所需微生物能从自然界混杂的群体中分离得到。（1）利用选择培养基进行直接分离（2）富集培养：利用不同微生物间生命活动特点的不同，在特定条件下使仅适应于该环境的微生物旺盛生长，从而增加其在群落中的数量，以便从自然界中分离得到所需微生物。6.二元培养物只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物，这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。7选择培养基分离法1.dilutesample1ml9ml10

1001000104105

106107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基87.微生物保藏技术微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护微生物资源的一项重要基础工作。

（1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。（2）保藏方法①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷藏。②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。③真空冷冻干燥法保藏④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。⑤其他保藏方法：曲法，麦粒法，无水硅胶法等。91995年7月1日起，布达佩斯条约国际保藏成员单位中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM，ChinaCommissionofCultureCollectionofMicrobe）：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC，ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter）。中国科学院典型培养物保藏委员会（TCCCAS，TypeCultureCollectionofChinaAcademicScience）：中国典型培养物保藏中心（CCTCC，ChinaCenterforTypeCultureCollection）。美国典型菌种保藏中心（ATCC，AmericanTypeCultureCollection）美国北部地区研究实验室（NRRL，AgriculturalResearchServiceCultureCollection）荷兰霉菌中心保藏所（CBS，CentralBureauvoorSchimelCultures）英国国家典型菌种保藏中心（NCTC，NationalCollectionofTypeCulture）日本大阪发酵研究所(IFO)10

分辨率：能辨别两点之间最小距离的能力。

反差：样本区别于背景的程度。

1.显微镜的种类及原理

（1）普通光学显微镜：主要由物镜、目镜和聚光镜三部分组成光学系统。最大放大倍数1600倍；分辨率0.2μ，与光波波长、物镜数值孔径相关，用Abbe公式表示d=0.61λ/nsinθ；n:物镜与物体间介质折射率；θ：光束进入物镜的半角（镜口角）；nsinθ：数值孔径NA（NumericalAperture）。二、显微镜和显微技术11

（2）暗视野显微镜普通光学显微镜属于透射照明，即照明光线直接进入视野。采用特殊的聚光器，实行斜射照明，样品反射后的照明光线进入物镜，视野是暗的，样品是明的，反差增大。实体显微镜或解剖镜。12

（3）相差显微镜（Phasecontrastmicroscope）

F.Zernike发明，基本原理是：光线通过不同折射率和厚度的标本时，直射光和衍射光的光程有差别，加快或落后的相位发生变化—产生相差，通过环状光澜和相位板，利用光的干涉现象，把光的相位差转变为肉眼可见的振幅差，使透明物体表现出明显的明暗差异，可看到细胞内的某些细微结构（4）荧光显微镜（Fluorescencemicroscope）有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线，并转放出一部分光波较长的可见光—荧光。用紫外线作光源，在暗背景下，发荧光的物体表现为光亮样本——荧光显微镜的原理；可对细胞的特定物质进行定性、定量、定位分析。自发荧光：激发光；诱发荧光：诱导剂，单胺类物质，甲醛熏蒸；荧光染料染色：吖啶橙，溴化乙锭等。13（5）透射电镜（TEM，Transmissionelectronmicroscope）

1933年，德国人E.Ruska发明。电子枪发射的电子射线在几万伏的加速电压作用下，产生短波长高能电子束，带负电荷，具有光的波动性，电磁场（电磁透镜）起着透镜的作用，有聚焦特性；电子束照射到样品上，电子与样品发生多种效应，形成透射电子和散射电子—透射电镜的信号来源；样品不同部位的结构不同，散射电子的能力不同，透过样品的电子束发生疏密差别，荧光屏上就出现了明暗区；样本厚度要小于0.1µ，生物样品要用重金属染色。14

电子束与样品发生的效应，除透射电子和散射电子外，与原子发生碰撞，形成背散射电子；被样品吸收，产生二次电子、特征性X射线、阴极荧光、俄歇电子等。电子与样品发生的多种作用吸收电子散射电子散射电子透射电子特征X射线俄歇电子二次电子背散射电子

入射电子束15普通光学显微镜和电子显微镜的比较16

分析电镜（Analyticelectronmicroscope）：收集特征性X射线作为元素分析信号；有X射线波谱分析仪：分析X射线波长；X射线能谱分析仪：分析X射线强度。

（6）扫描电子显微镜（SEM，Scanelectronmicroscope）利用二次电子信号成像，观察样品的表面形态，即二次电子的数量与样品材料性质、样品表面状态相关。

（7）扫描隧道显微镜（STM，Scantunnelingmicroscope）

1981年，IBM苏黎世实验室的Binning,Rohrer，Gerber和Weible发明。利用量子力学的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到1nm高度上扫描样品的表面时，针尖与样品间产生隧道效应，隧道电流（I）与针尖、样品间距离（d）有指数关系，由于隧道电流可以测定，故针尖位置可以确定，样品表面形貌就可以确定。

原子力显微镜（Atomicforcemicroscpe）：利用激光监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面的形貌信息。17(8)激光共聚焦显微镜激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量,配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。182.显微观察样品的制备

（1）光学显微镜的样本制备①活体观察：压片（滴）法；悬滴法；菌丝埋片法。②染色观察活菌染色法死菌正染色负染色：简单染色法鉴别染色法革兰氏染色法

抗酸性染色法芽孢染色法荚膜染色法等

活菌:用美蓝或TTC（氯化三苯基四唑）等作活菌染色

姬姆萨染色法19

（2）电子显微镜的样品制备生物样本需固定、干燥；重金属染色或喷镀。①透射电镜样品制备：用覆盖有支持膜（塑料、碳、金属膜等）的载网（铜网）来承载样品。

负染色技术：电子密度高，本身不显示结构，且不与样品反应的物质，如磷钨酸钠（钾）。

投影技术：在真空状态下，将铂、铬等强散射电子的原子由样品的斜上方进行喷镀，提高样品反差。

超薄切片技术：生物样本要制成100nm以下切片。步骤：取样固定脱水浸透与包埋切片捞片染色。固定用戊二醛和俄酸双重固定；包埋用环氧树脂；染色用铀或铅。

冷冻蚀刻技术：也称冷冻复型，主要用于膜结构研究。步骤：速冻冷冻断裂加热升华断面喷铂、碳腐蚀掉生物样品复型膜。

整装细胞技术：用于细胞骨架研究，载网上培养细胞。20

②扫描电镜的样品制备

SEM主要用于生物样品的表面特征研究，样品制备包括观察面暴露，固定、干燥、导电等过程；关键是干燥和喷镀金属导电层。冷冻蚀刻标本制作21

三、微生物形态细胞型微生物包括细菌、古生菌和真核生物。

1.细菌和古生菌

（1）细菌①个体形态球状：单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌，葡萄球菌；杆状：长杆菌、短杆菌；螺旋状：弧菌、螺旋菌。22四联球菌葡萄球菌链球菌杆菌（长杆菌，短杆菌）螺旋菌（弧菌、螺菌、螺旋体）23

其它形状的细菌柄杆菌：有柄、菌丝附器等胞质伸出物；球衣菌能形成衣鞘；枝原体、变形菌具有高度多型性。细菌的形态明显受环境条件的影响，培养时间、温度、培养基组成、浓度等发生改变，均引起形态的改变。幼龄阶段和生长条件适宜时，形态正常，在较老的培养基中或不正常条件下，出现异常形态。

畸型：理化因素刺激，阻碍了生长发育，引起形态的异常变化。

衰颓型：培养时间过长，营养成分贫乏，代谢产物积累等原因造成中毒，引起形态异常；转移到新鲜培养基内，条件适宜，可恢复原来形态。24

放线菌(actinomyces)：是一类具有丝状或枝细胞的细菌。

基内菌丝（Substratemycelium)：又称营养菌丝，吸收营养，排泄废物。

气生菌丝（Aerialmycelium)：基内菌丝长到一定时期，长出培养基外，伸向空间的菌丝。

孢子丝(Reproductivemycelium)：当气生菌丝生长发育到一定阶段，气生菌丝上分化出的可形成孢子的菌丝。孢子的形状及在气生菌丝上排列的方式随种而异。2526②群体特征

细菌菌落形态：大小、形状、光泽、颜色、硬度、透明度、光滑度等特征。这些特征由组成菌落细胞的结构、生长行为及理化因素决定。正面图剖面图27半固体培养基上的培养特征固体斜面培养特征28沉淀生长混浊生长表面生长液体培养特征29

放线菌的菌落形态菌落质地硬而且致密，菌落小而不广泛延伸，菌落表面呈紧密的绒状或坚实、干燥多皱；接种针难以挑取，有时可挑碎，有时可将整个菌落挑起。由于菌丝和孢子常具不同色素，使菌落正面，背面呈不同色泽。30

（2）古生菌显微镜下，古生菌与细菌有类似的个体形态。它们多生活在一些条件十分恶劣的极端环境中，如隐蔽热网菌最适生长温度为105℃，而热原体也像支原体一样呈多型性。普通光学显微镜下用测微尺测大小

（3）原核生物细胞的大小

细胞的大小是细菌分类特征；不同细菌细胞大小不同；同一细菌的不同菌龄细胞大小不同；细菌细胞大小与营养条件等因素相关；细胞大小的测量结果只是近似值或平均值。显微镜测微尺或电子显微镜测量:球菌测直径，杆菌和螺旋菌测长和宽。最大的细菌为纳米比亚硫磺珍珠（Thiomargaritanamibiensis），长约0.75mm；最小的细菌为纳米细菌（nanobacteria），直径为50nm.31

2.真菌包括霉菌、酵母、蕈菌（大型真菌），属真核生物，种类多，形态各异，大小悬殊，细胞结构多样。

（1）霉菌也称丝状真菌，指生长在营养基质上形成绒毛状，蜘蛛网状或絮状菌丝体的真菌。五界分类系统中分属于真菌门的藻状菌纲、子囊菌纲、半知菌类。主要存在于偏酸性的环境中，其应用除传统的酿酒及其它发酵食品外，近年来的应用越来越广泛；大部分为腐生菌，部分引起工农业产品变质，少部分产生毒素或致病。①个体形态：菌体由分枝或不分枝的菌丝（hypha）构成，呈管状，菌丝有隔膜为多细胞，无隔膜为单细胞。32根霉（rhizopus）毛霉(mucor)囊梗囊轴孢子囊囊领33曲霉Aspergillus

足细胞分生孢子梗分生孢子顶囊QCc34青霉(penicillium)35

②菌落特征霉菌的孢子、菌丝接种在固体培养基表面形成丝状物称菌丝，交织在一起的菌丝称菌丝体；菌落由菌丝体组成，肉眼可见，曲霉呈绒毛状；毛霉呈絮状；根霉呈蜘蛛网状；青霉呈地毯状。36

（2）酵母菌

是一群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真菌；属真菌门，子囊菌纲或半知菌类；大多数为腐生菌；除传统的谷物酿酒和面包生产外，还用来生产核苷酸、辅酶、细胞色素C、单细胞蛋白或进行石油脱蜡，可