常用样品的种类

1-02生物样品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏

*生物样品：包括各种体液和组织。在体内药物分析中常用的是血液、尿液和唾液。血样

包括血浆、血清和全血。其中血浆（plasma）和血清（serum）为常用生物样品。 测定血中的药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而非全血中的药物浓度。 供测定用血样的采集：动物试验时，可从动脉或心脏取血；对与患者或志愿者，实行静脉血（或用毛细管采血）。 血浆的制备：将实行全血置于含有抗凝剂（如肝素、草酸盐、EDTA等）的试管中，混匀后，以2500～3000r/min离心5min使血浆与血细胞分别，上清液为血浆。 血清的制备：将实行全血在室温下放置0.5～1小时，待血液凝固后，用细玻棒剥离血饼，以2000～3000r/min离心5～10min，上清液为血清。 药物与纤维蛋白几乎不结合，血浆与血清中的药物浓度测定值通常是相同的。但血浆比血清分别快，且制取的量多，所以血浆较血清更常用。 血样实行后，应刚好分别血浆或血清，并立刻进行分析。如不能立刻测定，应置于具塞硬质玻璃管或聚乙烯塑料离心管中密塞保存。 短期保存时，可置于冰箱冷藏（4˚C）；长期保存需在-20˚C或-80˚C下冷冻贮藏。唾液 由腮腺、额下腺、舌下腺和口腔粘膜内腺体分泌液混合组成的。口腔粘膜受化学刺激，各唾液腺的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大变更。 唾液的采集：在安静状态下进行，漱口后15分钟收集；采集后立刻除去泡沫，并以3000r/min离心10分钟，取上清液分析。 若分泌量少，可转动舌尖促进唾液分泌，也可接受物理的（如嚼石蜡）或化学的（如酒石酸）方法刺激。但经刺激后唾液中的药物浓度会受影响。 唾液采集后，应在4˚C以下保存。尿液 其主要成分：水、含氮化合物（大部分为尿素）及盐类。 体内药物（原型或代谢物及其缀合物）的清除主要通过尿液排出。 尿液中药物浓度高，采集便利、且采集量大。但尿液浓度变更较大。尿液中药物浓度的变更不能干脆反应血药中的浓度。 尿液测定主要用于药物剂量回收，尿清除率、生物利用度、以及药物代谢及其代谢途径、类型、速率等的探讨。 采集的尿液是自然排尿。 测定尿中药物的总量时，应收集用药后的确定时间内（如8h、12h或24h）排泄的全部尿液，记录体积后，量取一部分用于药物浓度的测定，在乘以尿量求得排泄总量。 肾功能不良者不宜采集尿样。 尿液采集后应立刻测定，否则应加入防腐剂后置于冰箱中保存。 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、三氯甲烷，以及醋酸、盐酸等。二、生物样品分析前处理技术 **生物样品的前处理应主要考虑生物样品的种类、被测药物的性质和所接受的测定方法。 依据生物样品类型：血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出。唾液样品应接受离心去除粘蛋白。尿液样品常接受酸或酶水解药物使从缀和物中释出。 依据被测药物的结构及性质，以及存在形式：药物的酸碱性与溶解性涉及药物的萃取手段。是否具有挥发性涉及能否接受气相色谱法测定。光谱特性及官能团性质涉及是否须要制成衍生物。浓度大的样品对前处理要求低，浓度越低的样品对前处理要求越高， 依据所接受的测定方法：纯化程度与所接受的测定方法的专属性、检测系统对不纯样品污染的程度亲密相关。放射免疫测定法具有较高的灵敏度和专属性，生物样品只需经初步处理除去主要干扰物即可测定。高效液相色谱法要求除去生物样品中的蛋白质，以防止蛋白质等物质在色谱柱上沉积。蛋白质的去除缘由：除去蛋白质可使蛋白质结合型的药物释放出来。避开溶剂萃取过程中的乳化现象。疼惜仪器性能（如疼惜HPLC柱不被玷污），延长运用寿命。方法：加入与水混融的有机溶剂有机溶剂使蛋白质凝合，释放与之结合的药物。常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃。含药物的血浆与有机溶剂的体积为1:(1～3)时，可除去90%以上的蛋白质。加入中性盐中性盐使溶液离子强度发生变更，将与蛋白质结合的水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐加入强酸当溶液的pH低于蛋白质的等电点时，以阳离子形式存在的蛋白质可与酸根离子形成不溶性盐而沉淀析出。含药物血清与强酸比例为1:0.6混合，可除去90%以上蛋白质。常用强酸：10%三氯醋酸、65%高氯酸、5%偏磷酸。过量的三氯醋酸经加热分解为三氯甲烷和二氧化碳而除去。过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和后，加乙醇使之生成高氯酸钾（或钠）沉淀除去。偏磷酸可用同法去除。加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐而沉淀。含药物血清与沉淀剂比例为1:2混合。常用沉淀剂：CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH。酶解法测定某些与蛋白质结合坚实、且对酸不稳定的药物时，需用酶解法使蛋白质分解而释放出药物。常用酶：枯草菌溶素（适用pH：7.0～11.0，温度：50～60˚C）。缀合物的水解缘由：含羟基、羧基、氨基和巯基的药物可与内源性物质葡萄糖醛酸或硫酸形成葡萄糖酸酐或硫酸酯缀合物。缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂萃取。尿中药物多数呈缀合物状态，测定之前，需将缀合物中的药物释放出来。方法：酸水解：加入适量的盐酸溶液进行水解。酶水解遇酸及受热不稳定的药物，可用酶水解；酶水解具有较高的选择性、很少使被测药物发生降解，常被优先接受；常用葡萄酸酐酶或硫酸酯酶或二者混合物；但酶水解时间长、酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及污染色谱柱。有机破坏生物样品中的金属离子常与蛋白结合且难以用溶剂萃取，同时金属离子可耐受高温。测定生物样品中金属离子时，多接受有机破坏方法进行前处理。常用HNO3-HClO4作为消解剂，其破坏实力强，适用与各种生物样品。所得金属离子一般为高价态。仪器常用硅玻璃和磞玻璃制成的凯氏烧瓶。分别、纯化与浓集 生物样品中的药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，生物样品需进行分别、纯化与浓集处理。液-液萃取法多数药物是亲酯性的，而血样或尿样中的多数内源性干扰物是强极性的水溶性物质。有机溶剂萃取可去除大部分干扰物。有机溶剂的要求：对被测药物的溶解度大、沸点低、易于挥发浓集、与水不相混溶、无毒、不易乳化。常用有机溶剂：乙醚和三氯甲烷有机溶剂相与水相的容积比为1:1或2:1。多数药物是亲酯性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多数是酸性的，生物样品中的药物一般在碱性下萃取。对碱性pH不稳定的药物，可在近中性pH处用三氯甲烷和异丙醇萃取。中性药物则在pH=7旁边萃取。液-固萃取法 将具有吸附、支配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或内源性干扰物保留在担体上，用适当的溶剂洗去干扰物后，再用适当的溶剂将药物洗脱下来。优点：较少引入杂质、消退了乳化现象、萃取效率高、处理样品速度快，在室温下操作、适于处理挥发性及对热不稳定的药物。 担体：亲水性的硅藻土、疏水性的活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶。浓集末次少量溶剂萃取法 在末次萃取时加入的萃取液尽量少，使被测组分萃取到小体积溶剂中，然后干脆吸取适量供测定。挥发萃取溶剂法。避开干脆加热，防止被测组分破坏或挥发损失。挥发萃取溶剂的常用方法是干脆通入氮气流吹干。对与易随气流挥发或遇热不稳定的药物，可用减压法挥发溶剂。溶剂蒸发所用试管，底部应为尖锥形，便于最终量取。化学衍生化 药物中含有活泼H者（如-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH）均可被化学衍生化。生物样品经化学衍生化在进行分别的目的：使样品中的药物转变成具可被分别的性质提高检测的灵敏度增加药物的稳定性提高对光学异构体分别的实力GC中化学衍生化衍生化可使药物分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成无极性的、易于挥发的药物，从而降低GC温度。主要衍生化反应：烷基化、酰化、硅烷化。常用烷基化试剂：碘庚烷、叠氮甲烷、氢氧化三甲基苯胺（TMAH）等。常用酰化试剂：已酸酐、丙酸酐等。常用硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）。HPLC中化学衍生化衍生化目的：使在没有紫外可见吸取或吸取系数较小的药物生成有强吸取的衍生物，从而提高药物的检测灵敏度。HPLC常用衍生化试剂：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。接受不对称试剂使光学异构体生成非对映异构体衍生物，然后用HPLC测定。常用不对称试剂(S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯、(S）-N-五氟乙酰脯氨酰氯等。三、定量分析方法的验证 生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质干扰及个体差异等多种因素影响生物样品测定，必需建立生物样品分析方法，并对其进行验证。特异性 必需证明所测定的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应代谢物不得干扰测定。 对于色谱法，至少供应6个不同来源的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加标准物质色谱图及用药后的生物样品色谱图。标准曲线与线性范围必需用至少6个浓度建立标准曲线，应运用与待测样品相同的生物介质。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但标准曲线不包括零点。线性范围要能覆盖全部待测浓度，不允许外推未知样品的浓度。标准曲线上各浓度点的偏差的可接受范围一般规定为：最低浓度点的偏差在±20%以内，其余各浓度偏差在±15%以内.只有合格的标准曲线才能对临床样品进行计算。精密度与精确度选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和精确度验证。低浓度在定量下限的3倍以内，高浓度接近定量上限，中间选一浓度，每一浓度至少5个样品。精密度用样品批内和批间RSD表示，RSD一般应小于15%，在定量下限RSD旁边应小于20%。测定批内RSD，每一浓度至少5个样品；测定批间RSD应在不同天连续测定3批，至少45个样品。精确度一般应在85%～115%范围内，在定量下限旁边应在80～120%范围内。定量下限定量下限至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/10～1/20时的药物浓度，且精确度应在真实值的80%～120%内。RSD应小于20%，S/N应大于5.应由至少51个标准样品测试结果证明。样品稳定性 对含药生物样品在室温、冰冻、冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品存放时间和条件。留意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。提取回收率 应考察高、中、低3个浓度的提取回收率。其结果应一样、精密和可重现。质控样品 系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量限制。质量限制 在分析方法确证后起先测试未知生物样品，每个样品一般测定一次，必要时进行重复。 每个分析批应建立相应的标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的QC样品，每浓度至少2样本。 若一个分析批中未知样品较多，应增加各浓度的QC样品数，使QC样品数大于未知样品总数的5%。 QC样品测定结果的可接受标准为：偏差应小于15%，低浓度点偏差小于20%，最多允许1/3不在同一浓度的QC样品结果超限。 如Q