细胞对氧磷酶1(PON1)芳香酯酶活性比色法定量检测试剂盒产

细胞对氧磷酶1（PON1）芳香酯酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞对氧磷酶1（PON1）芳香酯酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过对氧磷酶1反应系统中，水解有机磷酸，释放出对硝基苯产物，出现吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体细胞裂解悬液样品对氧磷酶1的有机磷酸酶活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景对氧磷酶（parapxonase；PON；EC3.1.8.1）是一种水解酯类（esters）、有机磷酸酯（organophosphate）和内酯（lactone）的多态性酶，分成三个亚型：PON1、PON2、PON3。结构同源性在基因层面上达70%，在氨基酸层面上达65%。其中PON1，为钙离子依赖性和高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein；HDL）相关性糖蛋白，含有354氨基酸，43Kd分子量，分布在肝脏、肾脏、小肠和血清（50毫克/升）中。具有有机磷酸酶（organophosphtase）、磷酸三酯酶（phosphotriesterase）、芳香酯酶（arylesterase）和硫内酯酶（thiolactonase）等多重活性：PON1与HDL结合，水解各种LDL和HDL上的氧化性磷酯，以及芳香族羧酸酯、芳香族和脂肪族内酯等，例如杀虫剂对硫磷（parathion）降解产物对氧磷（paraoxon）、毒死蜱（chlorpyriphos）、神经毒因子沙林（sarin）和索曼（soman）、同型半胱氨酸（homocysteine）硫内酯、二氢香豆素（dihydrocourmarin；DHC）、γ-丁内酯（γ-butyrolactone）等，延缓和抑制低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein；LDL）氧化作用，阻止脂质过氧化物产生，保护脂蛋白以及质膜受到氧化损伤，达到抗粥样硬化（antiatherogenic）、解毒、抗氧化的功能。PON1活性降低与慢性肾衰、糖尿病、外周神经病变、家属性高胆固醇血症、心血管疾病、肝纤维化等有关。PON2为44Kd分子量，分布在脑、肝脏、肺、肾脏、睾丸等大多数组织中，但血清中测不到。PON2具有水解芳香酯和内酯酶的功能，但不能水解有机磷酸。具有细胞内抗氧化作用，预防粥样硬化等功能。PON3为40Kd分子量，主要分布在肝脏中，少量在肾脏中。主要水解各种内酯和环状羧酸酯，具有抗氧化功能。基于人工合成底物对硝基苯磷酸二乙酯（diethyl-p-nitrophenylphosphate），在对氧磷酶1的作用下，水解产生对硝基苯（p-nitrophenol）和磷酸二乙酯（diethylphosphate），通过对硝基苯产物吸收峰值的变化（405nm波长），来定量分析对氧磷酶1的有机磷酸酶活性。其反应系统为：PON1diethyl-p-nitrophenylphosphate→p-nitrophenol+diethylphosphate产品内容清理液（ReagentA）裂解液（ReagentB）120毫升10毫升缓冲液（ReagentC）底物液（ReagentD）阴性液（ReagentE）产品说明书20毫升2毫升1毫升1份保存方式保存底物液（ReagentD）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（ReagentD）具有毒性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于样品CAOZUO1的容器15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离（微型）台式离心机：用于样品制备比色皿或96孔板：用于光度测定的容器分光光度仪或酶标仪：用于光度分析实验步骤一、样品准备1．准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X107细胞）2．小心加入3毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面3．小心抽去清理液4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）5．加入3毫升清理液（ReagentA），混匀细胞6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g8．小心抽去上清液9．加入500微升裂解液（ReagentB），充分混匀10．转移到预冷的1.5毫升离心管11．强力涡旋震荡15秒12．置于冰槽里孵育30分钟13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf5415）14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备1.开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长405nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零2.从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化3.缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度三、背景对照测定1．移取850微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿2．加入100微升底物液（ReagentD）3．上下倾倒数次，混匀4．在37℃温度下孵育3分钟5．加入50微升阴性液（ReagentE）6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照（5分钟读数－0分钟读数）四、样品测定1．移取850微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿2．加入100微升底物液（ReagentD）3．上下倾倒数次，混匀4．在37℃温度下孵育3分钟5．加入50微升待测样品（100微克蛋白）6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5分钟读数－0分钟读数）五、计算样品活性[（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X17.1（毫摩尔吸光系数）X5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔对硝基苯/分钟六、酶标仪测定1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和待测样品2．分别移取215微升缓冲液（ReagentC）到96孔板里3．分别加入25微升底物液（ReagentD）到所有孔里4．轻轻摇动96孔板5．在37℃温度下孵育3分钟6．分别加入10微升阴性液（ReagentE）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里7．轻轻摇动96孔板8．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X0.25（体系容量；毫升）]÷[0.01（样品容量；毫升）X17.1（毫摩尔吸光系数）X0.6（光径距离；厘米）X5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克单位＝微摩尔对硝基苯/分钟注意事项1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作2．操作时，须戴手套3．底物液（ReagentD）具有毒性，注意操作安全4．系统测试过程中，背景测定仅需1次5．加样后3秒内光度测定6．测定值由低到高变化；测定可持续5分钟7．光度测定后，比色皿须清洗彻底8．样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性9．建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供Bradford蛋