疾病的基因治疗

疾病的基因治疗第一页，共五十四页，2022年，8月28日

基因治疗几个发展时期1980-1989 准备期 技术、宗教，伦理，法律1990-1995 狂热期 公众，媒体1996-至今 理性期 出现临床结果 第二页，共五十四页，2022年，8月28日人体基因治疗是一个多环节的复杂过程基因导入靶器官、靶组织、靶细胞间的交流基因表达水平和时空调控基因表达产物生物活性载体安全性 还存在许多迷惑和问题第三页，共五十四页，2022年，8月28日早期期望值过高，目前理论研究和技术的发展水平均还不能满足成功临床试验的需要，安全性问题还一直没有彻底解决。然而，目前对许多疾病分子机制和对基因载体的研究取得了长足的进步，为基因治疗较大范围临床试验开展打下了坚实的基础。第四页，共五十四页，2022年，8月28日选择 在治疗上合适的基因——已知其在某特定疾病中的病理、生理作用适当的基因导入系统——病毒或非病毒载体临床前试验的有效性和安全性评价临床实验的有效性检测手段第五页，共五十四页，2022年，8月28日一、基因治疗主要病种：

主要为对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。

第六页，共五十四页，2022年，8月28日Cardiacischaemia

(Heart)VEGFgene(vasculargrowthfactor),plasmid,intracardiac2000J.Isner

Limbischaemia

(Hands,Feet)VEGFgene(vasculargrowthfactor),plasmid,intramuscular1998J.Isner

aaaaaaSCID

(Immunodeficiency)IL2Rgene(gamma-Creceptor)retrov.,exvivoBM2000A.Fischer

HaemophiliaB(Blood)FIX,RV,Skinfibroblast,腹部皮下移植,1991,复旦大学FactorIXgene

(clottingfactor),aav,adenoIII,intramuscular1999-2000M.Kay,K.High1992，JerryHsueh(薛京伦）CysticFibrosis

(Lung,Pancreas)CFTRgene

(chlorinetranspor-ter),retrov.,aav,adenoII,localnosignificantresults

inspiteofseveraltrialsADAdeficiency

(Immunodeficiency)ADAnormalgene

(enzyme)retrovirus,ex-vivoBM1990F.Anderson,

2002C.BordignonDiseasetransferredfunctionClinicalResultsClassicalSGTmodelsandstrategiesadditional'popular'andemergingexamples:MorbusGaucher,MorbusParkinson,CriglerNjiar,OTCdeficiency,Duchenne'sMD,Restenosiscontrol第七页，共五十四页，2022年，8月28日二、遗传病基因治疗

1.第一个基因治疗的遗传病(1990):腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。ADA缺乏症是一种罕见的遗传病，患者ADA基因缺陷，不能产生功能性ADA酶。ADA缺乏的孩子一出生就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，需要在几乎无菌的环境中生存。ADA缺乏症能用PEG-ADA治疗，但这种药物十分昂贵（60,000美元/年），而且必须通过持续静脉注射来维持疗效。第八页，共五十四页，2022年，8月28日ADA缺乏症被选为第一个基因治疗试验有以下几点原因：单基因遗传病，功能清晰，基因小基因调控简单，只要“开启”状态ADA酶量无需精确调控：很少量的酶也可使患者受益，酶量很多也能耐受。第九页，共五十四页，2022年，8月28日2、血友病B基因治疗的实践与发展

血友病B（HemophiliaB）是一种由于凝血因子IX基因（hFIX）发生突变而引起的出血性疾病。其症状表现为自发性出血，严重者可因关节出血导致关节变形和残废甚至死亡。该病为X染色体连锁，在男性中发病率大约为1/100,000。第十页，共五十四页，2022年，8月28日血友病目前的临床治疗方法：蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重组FVIII，FIX，能有效地改善出血症状和延长生命，但是昂贵，且存在感染HIV，HBV（乙肝），HCV（丙肝）风险第十一页，共五十四页，2022年，8月28日蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效血友病A有10-40%的人群产生抑制物血友病B有5%的人群产生抑制物这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越的基因治疗的原因之一！第十二页，共五十四页，2022年，8月28日血友病是目前SGT最有希望达到理想疗效的遗传病病种现行血友病B治疗手段、效果不理想单基因遗传病不需要精确的表达调控，无需所有细胞表达表达广谱理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系）疗效易于评价血友病A：100-200ng/ml血友病B:5000ng/ml第十三页，共五十四页，2022年，8月28日血友病B基因治疗靶细胞选择exvivo: Invivo: 皮肤成纤维细胞 直接、连续注射角质细胞 内皮细胞上皮细胞成肌细胞造血干细胞骨髓基质细胞支持细胞第十四页，共五十四页，2022年，8月28日

尽管人体天然的FVIII和FIX都是由肝细胞产生的。然而，实验证明，由非肝细胞如CHO产生的重组凝血因子与人体天然的凝血因子在活性和免疫原性上没有差别，到目前为止没有发现非肝细胞产生的凝血因子有不同寻常的翻译后修饰。因此，肝细胞不一定是血友病基因治疗必然的靶细胞。第十五页，共五十四页，2022年，8月28日1）1991年，复旦大学反转录病毒介导的exvivo途径临床试验取得了安全有效的结果第十六页，共五十四页，2022年，8月28日反转录病毒载体XL－IX

5‘LTRFIXcDNANeoSOriPOri3’LTRN2CMV－IX5‘LTRNeoCMVFIXcDNA3’LTR第十七页，共五十四页，2022年，8月28日第十八页，共五十四页，2022年，8月28日第十九页，共五十四页，2022年，8月28日第二十页，共五十四页，2022年，8月28日2）2003年，以AAV-2/hFIX介导的直接肌肉注射，基因治疗血友病B方案已被批准临床试验（国家药品监督管理局药物临床批件，2003L00403）第二十一页，共五十四页，2022年，8月28日ITRCMVhFIXminigenePAITRITRCMVmFIXPAITRpAVChFIXmpAVCmFIXpAVChFIXmR重组AAV载体ITRCMVhFIXR338APAITR第二十二页，共五十四页，2022年，8月28日TransientExpressionofpAAV-hFIXs

inCellLines第二十三页，共五十四页，2022年，8月28日InvitroExpressionofAAV/mFIXmFIXlevel(ng/106cells/24h)第二十四页，共五十四页，2022年，8月28日ExpressionofrAAV-hFIXR338AinMice:第二十五页，共五十四页，2022年，8月28日ExpressionofmFIXinHemophiliaBMouse第二十六页，共五十四页，2022年，8月28日

血友病小鼠经rAAV基因治疗后,FIX凝血活性提高,出血症状改善第二十七页，共五十四页，2022年，8月28日3.2'<40ulAPTT<20''30‘430ulAPTT>100"7.5‘50ulAPTT34"BleedingAssay第二十八页，共五十四页，2022年，8月28日采用Westerndot-blot分析表明，于肌肉注射rAAV/hFIX病毒子后第15天，小鼠血液中即开始出现抗hFIX抗体，血浆中hFIX水平亦开始下降.经Bethesda分析,未发现抗小鼠IX因子抗体.0天3天15天27天39天阳性对照抗IX因子抗体分析第二十九页，共五十四页，2022年，8月28日肌注FIX后，抗体在7天后开始明显增加，15天时达到最高，约为正常对照的8倍左右，到60天时抗体的量开始减少，为正常对照的5倍，此后到120天，抗体的量基本不变。抗AAV抗体检测第三十页，共五十四页，2022年，8月28日建立了复制型AAV病毒检测的巢式PCR方法以及HSV病毒检测方法,提高了灵敏度。研究了肌肉注射重组AAV在体内的分布，分散程度与注射剂量成比例，主要分布在注射肌肉组织,经过半定量PCR发现肌肉中的载体数是其它组织的1,000－10,000倍。鼠类使用AAV毒性研究,病毒注射后血浆没有发现血清肌氨酸激酶水平的上升，体重没有改变，未见血清的化学参数或血液参数的改变。仅发现少量由淋巴细胞浸润导致的感染,无结构改变。安全性第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日以高剂量AAV病毒肌肉注射老鼠试验中，未引起组织毒性,所有动物脾大小正常，未发现囊泡区的增生。在注射区的骨骼肌仅有中等或轻微的慢性感染，感染仅限于肌束膜组织，无肌肉纤维解剖学上的改变。rAAV注射后,小鼠体内AAV抗体滴度增高.rAAV病毒随机整合问题第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日3）以其他载体系统进行血友病B基因治疗微小腺病毒载体介导hFIX小基因离体表达ELISA方法检测微小腺病毒(miniAd)及第一代腺病毒(firstAd)介导cFIX在血友病B小鼠血浆中的表达第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日VSVG假型RV介导的hFIXcDNA在血友病B小鼠中的基因治疗

VSVG假型RV滴度高，与传统RV比较抗补体灭活效应高，不同剂量病毒上清液腹腔注射新生血友病B小鼠，小鼠凝血功能改善，凝血活性提高3%以上，表达持续120d以上。第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日重组慢病毒载体介导人凝血IX因子的表达及宫内基因治疗重组慢病毒载体FUXWFAXW感染离体细胞293T、L-02、BHK72h后的hFIX蛋白表达重组FAXW.FUXW病毒在血友病B小鼠体内表达hFIX的时效曲线

HIV是基因组结构及基因调节机制最为复杂的逆转录病毒之一,基于HIV的重组反转录病毒载体，能广泛感染各种非分裂细胞,也保留了能够整合在宿主染色体上的特点.且免疫反应小,重组HIV是一个很有发展潜力的病毒载体ABP肝特异性启动子指导人的凝血因子IX的重组HIV载体：重组慢病毒载体质FUXW,FAXWD等第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日宫内胎鼠基因治疗第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日非病毒途径导入基因：尾静脉大容量快速注射法尾静脉大容量快速注射裸DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达，我们以凝血因子Ⅸ（hFⅨ）为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒转移体系。人FⅨ在小鼠体内的表达小鼠尾静脉大容量快速注射10µgCMV-hFIX质粒DNA(◆)，注射后不同时间采血，通过ELISA检测血浆中hFⅨ的水平。▲示Ringer’s液注射组。第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日

血友病基因治疗进展与展望

进展展望新的AAV血清型和慢病毒载体已成功改进慢病毒,gutlessAd和不同血清用于FVIII、FIX生产研究 型AAV正在开展除了肝脏外，其他器官也可以用于产生基因修复、RNA修复（Trans-FVIII、FIX

slicing）提供新的方案设计思路内源性因子合成和病毒载体引起的免疫以外周内皮源细胞实施基因修饰的反应是血友病基因转移的潜在威胁可能具有发展前景血友病临床试验正在开展以干细胞治疗实施的基因修饰将成（RV，AAV，或exvivo皮肤成纤维为可能细胞）第三十九页，共五十四页，2022年，8月28日4）总结

血友病基因治疗需要安全、有效、无免疫原性的转移系统，并要求持续表达，且必须优于蛋白替代法。血友病具有很好的的动物模型,HemA,HemB均有小鼠和狗模型，能模拟、预测临床症状、评价有效性和安全性，有助于临床前制定策略。目前已开展病毒和非病毒转移系统研究，病毒的工作占多数，但非病毒系统的工作可能更具魅力：可在无细胞系统中装配免疫原性小杂合非病毒载体系统将病毒某些成分加入系统，以提高基因转移效率，对血友病基因治疗很有吸引力第四十页，共五十四页，2022年，8月28日

三、肿瘤的基因治疗

目前，进入临床试验的基因疗法有70%是针对癌症的，虽然大多数尚未被肯定疗效，但代表了癌症治疗的方向。

恶性肿瘤基因治疗方案中，所用的治疗基因大致可归为三类：细胞因子类；杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶（HSV/TK）为代表；以p53为代表的抑癌基因及反义癌基因类。第四十一页，共五十四页，2022年，8月28日

2003年10月16日，全世界第一个基因治疗药物——p53腺病毒注射液由中国国家药品监督管理局颁发新药证书！第四十二页，共五十四页，2022年，8月28日常见癌症治疗方案外源性基因替补疗法

输注外源性抑癌基因p53可抑制或杀灭癌细胞。

抗原基因导入疗法

将组织相容复合体MHC基因转移给肿瘤细胞，MHCII型分子在肿瘤细胞表面大量表达，与肿瘤抗原结合形成复合抗原，从而暴露出“靶点”被免疫细胞识别和消灭

第四十三页，共五十四页，2022年，8月28日反义基因疗法

以癌基因DNA的有义链为模板合成出反义链，将其转入肿瘤细胞内，形成的双链核酸阻断癌基因表达和癌细胞增殖。自杀基因疗法

将自杀基因（又称前药转换酶基因如胸苷激酶tk基因和胞嘧啶脱氨酶CD基因等

）,导入癌细胞内，使癌细胞死亡。细胞因子基因导入疗法

将白细胞介素II、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子基因导入肿瘤细胞内，所产生的细胞因子可引起癌细胞死亡；也可将这些细胞因子基因导入肿瘤组织中淋巴细胞内，增强这些细胞的抗癌作用。第四十四页，共五十四页，2022年，8月28日我们的部分工作腺病毒载体介导的TK/ACV对大鼠脑胶质瘤离体/活体的杀伤作用第四十五页，共五十四页，2022年，8月28日

目前癌症基因治疗的研究大多是在观察毒副反应为主的Ⅰ期临床试验，极少数进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验，结果有待进一步观察。目前的临床研究进程很慢，这与癌症复杂的发病机制和有效载体的研发有关，虽然动物实验的结果不断涌现，但并不能完全代表人类，只有临床试验具有决定性的作用。就目前的研究成果来看，基因治疗可能会在手术、放疗和化疗以外，成为一种新的肿瘤治疗手段，特别可能对提高化疗、放疗的敏感性，减少肿瘤复发和转移等方面有一定的、甚至更为重要的作用，成为肿瘤综合治疗中的一个较为重要的组成部分。第四十六页，共五十四页，2022年，8月28日四、传染病的基因治疗第四十七页，共五十四页，2022年，8月28日（1）病毒性肝炎的基因治疗

病毒性肝炎基因治疗研究虽然取得了一系列的进展，但是，由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到最高水平。病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。第四十八页，共五十四页，2022年，8月28日病毒性肝炎基因治疗——最近部分工作XuRetal”MoleculartherapeuticsofHBV”CurrGeneTher.2003Aug;3(4):341-55.病毒学杂志.2003Mar;17(1):81-4.DingCLetal“ExpressionofHBcAgineukaryoticcellsbyretroviralvectormediatedgenetransfer”

中华实验和临床病毒学，2003Mar;17(1):81-4.

KleinCetal“InhibitionofhepatitisBvirusreplicationinvivobynucleosideanaloguesandsiRNA”Gastroenterology.2003Jul;125(1):9-18

HanJQetal“ApproachtotransforminghepatitisBvirusasagenetherapeuticvector”中华肝脏病杂志2003,Jun;11(6):344-6.第四十九页，共五十四页，2022年，8月28日（2）AIDS基因治疗----近期一些工作ZhangDetal:“OptimizationofexvivoactivationandexpansionofmacaqueprimaryCD4-enrichedperipheralbloodmononuclearcellsforuseinanti-HIVimmunotherapyandgenetherapystrategies”JAcquirImmuneDeficSyndr.20031;32(3):245-54.

AnanthalakshmiPolurietal“GenetictherapyforHIV/AIDS”ExpertOpiniononBiologicalTherapy.2003,vol.3,no.6,pp.951-963FanningGetal“GenetherapyforHIV/AIDS:thepotentialforanewtherapeuticregimen”JGeneMed.2003Aug;5(8):645-53

AkkinaRetal“siRNAs,ribozymesandRNAdecoysinmodelingstemcell-basedgenetherapyforHIV/AIDS”AnticancerRes.2003May-Jun;23(3A):1997-2005.

第五十页，共五十四页，2022年，8月28日（3）SARS基因治疗反义技术？？？

在“反义”技术领域潜心耕耘了23载的AVI公司一直不为外界所知，直到非典出现，该公司一鸣惊人。事实上，AVI公司只花了几天时间，就把对付田鼠冠状病毒和企