基于纳米颗粒增强剂酶循环放大的表面等离子共振生物传感器的研究

基于纳米颗粒增强及酶循环放大的

表面等离子共振生物传感器的研究

主要内容提纲相关研究背景实验部分结论攻读学位期间发表的论文致谢一、相关研究背景1.

生物传感器简介2.

表面等离子共振生物传感器3.DNA及酶的检测的意义4.放大体系5.本课题的目的、意义及研究内容1.生物传感器生物传感器由识别元件、信号转换器和信号处理器三部分构成，通过信号转换器将被测物与生物敏感膜特异性结合后所产生的生物的、化学的和物理的等信息转变成电信号、光信号、热信号等，从而达到分析检测被测物的目的。近些年来，生物传感器在医学诊断、食品营养、环境监测、国防工业及人类卫生保健等诸多领域得到了广泛的应用，尤其是在生物研究领域，如DNA检测、生物分子、蛋白质及细胞检测等，更是得到了快速的发展。2.表面等离子共振生物传感器表面等离子共振生物传感器的组成及原理表面等离子共振生物传感器的优势表面等离子共振生物传感器的应用2.1.表面等离子共振生物传感器的组成及原理结构：表面等离子共振传感器包括液体动力、进样、模式选择及样品检测四个部分原理：偏振光在入射到蒸镀有金膜的棱镜端面，发生全反射，消逝波将激发自由电子，产生表面等离子共振波，当大部分消逝波的光能耦合到表面等离子波时，将会使棱镜中全反射光强迅速减少，这种情况下全反射的角度即为共振角。实验中预先将传感器芯片修饰上某种具有特异性的物质，流动样品与其特异结合，以电信号的形式将共振角变化反应出来。2.2表面等离子共振生物传感器的优势表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)生物传感技术是基于引起折射率变化的生物检测技术，这种微小的折射率变化与芯片上修饰的探针分子与靶物质的特异性结合成正向关联。与传统的生化分析方法相比，SPR的关键优势在于靶物质可以直接实时检测而不需要标记，同时具有灵敏度高、稳定快速、便捷实时，能够实现在线实时连续检测等适合生化分析的优点，其检测灵敏度较高，可以用于浓度介于皮摩尔到飞摩尔水平范围的微量物质检测。2.3表面等离子共振生物传感器的应用表面等离子共振生物传感器在薄膜光学、蛋白质组学以及检测分析分子之间的反应动态等领域均有较广泛成熟的应用，可以通过实时监测SPR共振角，进而对生物分子动态结合进行求证，同时也可以推断出被分析物的浓度、亲和力、反应动力学常数和特异性等信息[18]。商品化表面等离子共振仪已经发展成熟，并涉及到人类健康及生活水平的提高的多个领域均有广泛的应用[19-21]。3.1凝血酶检测的意义凝血酶是一种重要的丝氨酸蛋白酶，凝血过程中发挥着巨大作用，同时作为活性物质，不仅参与了人体血液正常生理活动，在抑制炎症和促进伤口愈合方面也有重要作用，研究凝血酶的浓度可以与很多常见病得发病机理相联系，因此对凝血酶进行微量准确快速的分析检测对人类的生命及健康具有重要的意义。3.2DNA检测的意义DNA生命的密码，它编排了生命操纵着生命，作为细胞和病毒基因的载体的特定序列的DNA，为诊断疾病及研究病理作用方面，提供了特别重要的信息，并且在基因治疗、基因预防以及实施用药个体化的几个方面，都离不开DNA的检测，因此DNA的快速、高灵敏检测在分子生物学和临床诊断具有极其重要的意义。4.1生物素-亲合素系统(biotin-avidinsystem，BAS) 生物素-亲合素系统(biotin-avidinsystem，BAS)是一种新型生物反应放大系统。具有高度亲和力及多级放大效应，特异性强，分子量大，亲和力强，稳定性好，这些性质使亲和素-生物素体系在SPR在线检测中得到较好的应用。4.2滚环复制放大滚环复制放大技术（RCA)是一种基于DNA或RNA引物沿环状DNA等温滚动复制来实现核酸扩增的技术，这种技术具有相对无限单链扩增，不需要对模板进行特殊的变性，快速、特异、灵敏等优点，近年来，被广泛应用于基因检测、临床诊断方面的研究中。5.本课题的目的、意义及研究内容癌症作为人类健康三大杀手之一，有着很高的死亡率，对微量肿瘤标志物的准确灵敏检测，是早诊断早治疗的基础。检测凝血酶、核苷酸，对于癌症的早期诊断具有重要的意义。本论文主要结合了纳米技术、特异性结合原理、生物条码技术以及滚环复制放大手段等，对信号起到了放大的作用，被放大的信号，再通过表面等离子共振仪的检测进行转换，得到可以量化的数值，从而对微量的靶物质进行定性定量检测。二、实验部分基于纳米颗粒信号放大的SPR生物传感器的研究

（第二章）基于滚环复制放大技术的SPR检测凝血酶的研究

（第三章）基于酶循环放大的SPR检测DNA的研究

（第四章）第二章

基于纳米颗粒信号放大的SPR生物传感器的研究

1.实验原理：2.实验步骤Au纳米粒子的制备生物条码的制备基底的修饰生物素-亲和素特异反应SPR生物传感器在线检测金纳米粒子的透射电镜图3.结果与讨论纳米金功能化磁珠制备的紫外检测图DNA修饰金纳米颗粒表征图：（a）DNAS3（b）DNAS4（c）AuNP（d）AuNPbio-bar-code金纳米粒子的曲线（曲线c）DNA的曲线(曲线a,b)在520nm处和260nm处分别出现了二者的特征峰，修饰有DNA的金纳米粒子的特征曲线（曲线d）同时具有520nm处和260nm处的吸收峰。结论：表明DNA已经成功的连接到Au纳米粒子上3.结果与讨论

2.3.3

实验最佳条件的优化

为了提高检测的灵敏度，本文对仪器的使用条件及样品的处理进行了优化，使表面等离子共振仪在生化样品检测中达到最佳使用性能，针对通过DNA修饰的纳米金粒子进行信号放大检测靶DNA这个示例实验，对其基底的修饰方式，基底修饰物的滴涂位置、进样流速模式及在线实验温度等进行了优化，得到了比较理想的优化效果。3.结果与讨论生物条码的优化(两种DNA修饰的金纳米粒子(A)，一种DNA修饰的金纳米粒子(B),单纯DNA互补杂交(C).)结论： A,B,C对应角度分别为0.5，0.36和0.02，从数据中可以看出两种DNA修饰的金纳米粒子形成的生物条码对信号具有明显的增强作用。3.结果与讨论基底修饰方式的优化在线用修饰亲和素-生物素DNA修饰基底的SPR角度变化图,通入条码前(A),通入条码后(B):△ϴ=0.5离线用修饰亲和素-生物素DNA修饰基底的SPR角度变化图,通入条码前(C),通入条码后(D):△ϴ=0.83.结果与讨论基底修饰方式的优化在线用巯基DNA修饰基底的SPR角度变化图，通入条码前（E），通入条码后（F）:△ϴ=0.3离线用巯基DNA修饰基底的SPR角度变化图，通入条码前(G)，通入条码后(H):△ϴ=0.553.结果与讨论基底修饰方式的优化结论：基底修饰方式选择亲和素-生物素系统，且离线修饰，信号最佳。基底用亲和素-生物素DNA与巯基DNA离线修饰SPR曲线对比图：巯基DNA(I),亲和素-生物素DNA(J),△ϴ=0.253.结果与讨论

基底修饰位置的优化不同修饰位置①空金片②于管道正中间滴涂小点③按照管道形状滴涂④点在两管道中间⑤涂满整个芯片3.结果与讨论

基底修饰位置的优化不同基底修饰位置对应的SPR曲线:①空金片△ϴ=0(E);②于管道正中间滴涂小点(A)△ϴ=0.53;③按照管道形状滴涂(B)△ϴ=0.535;④点在两管道中间(D)△ϴ=0;⑤涂满整个芯片(C)△ϴ=0.538结论：按照管道形状滴涂这种基底修饰方式，既可测得较强的信号，又可以节约试剂，降低实验成本。3.结果与讨论

进样流速模式的优化SPR共振角度偏移与流速关系图:20μL/min(D)△ϴ=0.48,50μL/min(C)△ϴ=0.5,60μL/min出信号后调整为20μL/min(A)△ϴ=0.58,80μL/min出信号后调整20μL/min(B)△ϴ=0.54结论：采用以60μL/min流速进样，出信号后调整为20μL/min这种进样模式，得到的SPR响应值最大3.结果与讨论

检测池温度优化在实验过程中，温度也是一个重要的影响因素。在SPR生物传感器中，最常见的待测物质为生物分子的水溶液，其折射率受温度的影响与纯水类似，在同一波长下，随着温度的升高，水折射率逐渐减小，且温度越高，减小的幅度越大。所以对于对比试验，应设置相同的检测池温度，此外，本实验所使用的芬兰BioNavis公司生产的SPRNavi200型表面等离子体共振生物传感器的可设置温度范围为低于室温5℃或高于室温15℃，但经过多次试验总结，温度过高或过低均易导致检测池漏气，影响检测效果，所以一般实验时温度设为高于室温2℃左右。4.小结 本章设计了一种基于纳米金粒子质量放大SPR信号，对表面等离子共振仪生物传感器检测方式进行了探索，得到了较好的实验条件，并应用该实验条件，利用亲和素-生物素DNA为基底，通过生物条码进行信号放大，对靶DNA进行了检测，得到了较理想的SPR响应信号。第三章基于滚环复制放大技术的SPR检测凝血酶的研究

1.实验原理：Au纳米粒子的制备生物条码的制备基底的修饰滚环复制扩增放大体系的连接SPR在线检测凝血酶2.实验步骤3.结果与讨论实验的可行性检验SPR检测凝血酶的可行性:空白(C),1×10-12mol/L的凝血酶，不进行滚环放大（B）,1×10-12mol/L的凝血酶,滚环放大（A）结论：C,B,A对应信号分别为：0.35，0.5，2.82，从而证明本实验的合理性以及滚环放大反应的有效性。3.结果与讨论反应温度的优化(Cthrombin=1.0×10-13mol/L)结论：反应的最佳温度为37℃3.结果与讨论体系聚合反应时间的优化(Cthrombin=1.0×10-13mol/L)结论：体系的最佳反应时间为120min3.结果与讨论聚合酶浓度的优化结论：聚合酶最佳使用浓度为0.25U/ml3.结果与讨论纳米金粒径的优化结论：最终确定最佳的纳米金粒径为41.5nm3.结果与讨论

生物条码两种探针DNA比例的优化结论：在凝血酶浓度为10-13mol/L时，随着S4:S3的值增大到20:1，信号提高至1.98，此后随着探针比例增大信号成下降趋势。最终确定探针比例为S4:S3=20:13.结果与讨论

选择性检测不同蛋白质的SPR响应信号：空白（Blank）；通入甲胎蛋白（AFP）；通入溶解酵素（lysozyme）；通入牛血清蛋白（BSA）；通入凝血酶（Thrombin），蛋白的浓度均为100pgmL-1。结论：利用凝血酶抗体与适体对于凝血酶的特异结合，用来检测凝血酶具有非常好的特异性3.结果与讨论

SPR对于凝血酶的检测不同浓度的凝血酶对应的SPR角度变化不同浓度的凝血酶与SPR角度的关系结论：在凝血酶浓度为1×10-16mol/L至1×10-11mol/L的范围内，检测信号可成线性，其线性方程为：Y=0.5051log10C+8.4928其中R1=0.9926，其检测限为1×10-16mol/L。

3.结果与讨论

SPR检测体系的实用性研究结论：采用加标回收法，将不同浓度的凝血酶加入到人血清样品中，每份样品重复三次进行检测，测得加标回收率为95.63~98.3%，相对标准偏差为5.9~7.8%。实验结果表明，该方法具有实际临床应用潜力，能够对复杂生物样品进行分析检测。4.小结 本章基于滚环复制放大技术，以及生物条码技术，对检测凝血酶的信号进行放大，利用凝血酶与其抗体及适体的特异性结合反应，使被放大的体系在SPR生物传感器的芯片上得到固定，实现了对凝血酶的微量检测，并且通过对反应温度、时间，聚合酶的浓度，以及生物条码进行了条件优化，得到了检测限为1×10-16mol/L的实验结果，同时通过加标回收实验验证了此方法的实用性，赋予此方案较佳的临床应用性。第四章基于酶循环放大的SPR检测DNA的研究1.实验原理：生物条码的制备基底的修饰MB-DNA的组装S2的开环反应表面等离子共振检测DNA2.实验步骤3.结果与讨论可行性对比实验 对照实验的SPR图谱,加入1×10-12mol/LS1(A),空白无S1(B)，在有靶DNA(S1)存在时，有较大的SPR信号1.6左右，在没有靶DNA（S1）存在时，几乎没有SPR信号。结论：通过此实验能够确定方法的可行性与合理性。3.结果与讨论基底浓度的优化分别在金片上滴入30µL浓度为1×10-7mol/L，5×10-7mol/L，1×10-6mol/L，5×10-6mol/L，1×10-5mol/L处理好的茎环状态S2反应12小时，X轴为S2浓度的对数值,Y为SPR角度变化值

结论： 确定基底修饰DNA（S2）的浓度为1×10-6mol/L。3.结果与讨论反应温度的优化

结论： 我们选择体系的反应温度为37℃。将酶循环过程分别置于20℃、30℃、37℃、45℃、50℃下反应。3.结果与讨论聚合酶的用量的优化结论：50µL的反应体系中聚合酶最佳用量为1µL50µL的反应体系中聚合酶用量分别为：0.2µL、0.5µL、1µL、1.2µL、1.5µL3.结果与讨论酶循环反应时间的优化结论： 酶循环反应的最佳反应时间是90min。分别反应20min、30min、40min、60min、90min，120min，其中不加S1空白试验作为对照实验。3.结果与讨论选择性实验结论：该生物传感器表现出良好的选择性，适用于复杂基因样品的分析测定。实验选用1.0×10-12M的完全互补t-DNA，两碱基错配的t-DNA和完全非互补t-DNA分别进行杂交反应，对该生物传感器的选择性进行了研究。完全互补靶DNA可产生较强的SPR角度迁移(4)，同样浓度两碱基错配的t-DNA只产生极弱的SPR角度变化(3)，而完全非互补的靶DNA则基本没有信号响应(2)与空白试验(1)基本一致。3.结果与讨论检测灵敏度结论：当S1的浓度在1.0×10-14~1×10-12mol/L时，SPR角度随着靶DNA浓度的增大而增强，信号强度与靶DNA浓度成线性关系，其线性回归方程为Y=0.6844log10C+9.7402（Y为SPR角度变化；C为靶DNA的浓度，R2=0.9854）。检测限为7.8×10-15M（3σ）。在最佳检测条件下进行循环反应，向体系中聚合酶Klenow1µL，聚合酶Buffer5µL，脱氧核苷三磷酸dNTPs5µL，以PBS分散的磁珠10µL，分别加入15µL1.0×10-12M、5×10-13M、1.0×10-13M、5.0×10-14M、1×10-14M的靶DNA，并以PBS补全50µL体系在37℃下，进行酶循环反应90min，加入生物条码在线检测SPR角度变化信号。3.结果与讨论检测灵敏度相对SPR信号与靶DNA浓度对数值的标准曲线,X轴为靶DNA浓度的对数值,Y为SPR角度变化值4.小结 本章基于碱基互补配对、酶循环放大反应，结合磁性微球、生物条