粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清tnfα、il8的影响课件

研究生：蔡景融导师：武华教授2015年4月粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清TNF-α、IL8的影响专业：普通外科研究方案研究基础研究计划及预算国内外研究进展选题依据

Content粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-α、IL8的影响选题依据

溃疡性结肠炎(UC)是一种病因和患病机制还未完全阐明，可能与微生态环境、黏膜的免疫应答、应激、遗传等因素有关的慢性肠道炎症性疾病，病变主要局限于结直肠粘膜及粘膜下层，可累及整个结肠甚至末端回肠。目前研究发现，与健康人相比，UC患者肠道中微生物的多样性减少约1/4，拟杆菌门与厚壁菌门在总菌群中所占比例明显减少，而放线菌门与变形菌门的比例明显增加。肠道菌群是机体一个特殊器官，其调节机体免疫、调控炎症、参与物质代谢等方面发挥重要作用。

肠道菌群的生理作用1.防御病原体的侵犯2.物质代谢作用3.生长与衰老4.合成维生素5.肠道的生物、免疫屏障作用选题依据

传统的升阶治疗方案，序贯地应用5-氨基水杨酸、糖皮质激素与免疫抑制剂，无疑最为安全易行、经济实用；然而无限期地等待疗效，可能错失治疗良机，延误缓解时间，使约50％患者仍处于活动状态，导致失用或致残的并发症，其疗效费用比反而降低。随着新药问世后治疗经验的积累，专家们提出早期、强力治疗，即降阶治疗方案。这种看似昂贵、危险，实则经济、高效的治疗方法已使相当多的IBD患者获益，但降阶治疗药物昂贵，又有一定风险，如严重感染、药物反应等，对非选择性病例也存在过度治疗之嫌，而且停药或减药后病情仍会发复发作，并表现出一定的激素依赖性。对常规治疗失败或有手术禁忌证的UC病人，FMT或许是不错的选择。目前FMT应用最为广泛的是治疗复发性难治性难辨梭状芽胞杆菌感染(CDI)肠炎，其短期缓解率可达90％以上。FMT也在其他多种疾病中被用于试验性治疗，都取得了良好的效果，如IBD、IBS、肥胖、代谢综合征、糖尿病等。还有FMT被成功运用于系统性硬化病、帕金森病、慢性疲劳综合征和特发性血小板减少性紫癜等的个案报道。

国内外研究进展1检测指标及意义3实验方案2创新之处及可行性分析4研究方案研究目标和内容（1）分组情况（2）模型建立（3）粪菌液的制备（4）指标检测（5）

Chiu氏6级评分法评估损伤程度

（6）统计学分析2实验方案2.1分组情况健康SD大鼠54只，雌雄各半，体重200-250g，由山西医科大学生理实验室提供。随机分成3组：空白对照组(A组)、模型对照组（B组）、粪菌液模型组（C组），每组18只。其中A组为正常大鼠，给予无菌生理盐水保留灌肠，每天一次，自由饮水、进食。B、C两组为溃疡性结肠炎模型大鼠，分别给予无菌生理盐水、粪菌液保留灌肠，每天一次，自由饮水、进食。（生理盐水量、粪菌液量按体重换算）2.2模型建立大鼠造模前1d禁食24h，不禁水，称重后，3％的戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，5％2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSW/V)按100mg/kg加入等体积50%乙醇溶液；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段8cm，注射器注人。再倒立1～5min左右，以防药液溢出，一次性灌肠。2.4指标检测

2.5Chiu氏6级评分法评估损伤程度

分别于造模后3d、7d、11d每组各取6只大鼠，3％戊巴比妥钠麻醉后开腹，使用一次性采血针穿刺门静脉取全血2ml，待低温离心后，再吸出上清液，置于一80℃冰箱中保存备用，采用酶联免疫法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-8浓度。取肛门以上8cm肠段卷起，置10％中性甲醛中固定、石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜下观察。并且于取材完毕后采用颈椎脱臼法处死相应大鼠。2.6统计学分析采用Spss13.0统计软件包进行分析，各组实验数据用均数±标准差表示，血清学指标比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3检测指标及意义TNF-α主要由脂多糖(LPS)激活的单核巨噬细胞产生，对免疫反应、机体代谢、炎症反应、抗肿瘤均有重要的调节介导作用。1.溃疡性结肠炎中TNF-α分泌水平及其mRNA表达高于正常组或未受累结直肠粘膜。2.TNF-α不仅能刺激巨噬细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和内皮细胞分泌花生四烯酸代谢物、细胞因子和蛋白酶，还能吞噬细胞产物和补体片段引起细胞坏死、间质中蛋白质破坏和水肿的发生，从而促进胃肠细胞的组织损害。3.TNF-α可使中性粒细胞聚集，内皮细胞粘附分子上调以及增加上皮紧密连接的通透性和抑制上皮细胞的生长等，还可诱导结肠上皮细胞凋亡，破坏肠粘膜屏障，同时血管系统也遭到破坏，通过以上途径导致一系列溃疡性结肠炎典型的炎症病变。IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子，由单核细胞、上皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF和外源性因子细菌多糖(LPS)的刺激下产生,其主要生物学作用是1.趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用,对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用。2.临床试验发现IL-8在UC患者的肠黏膜上皮中高表达并且IL-8水平与结肠炎的严重程度呈正相关。检测指标及意义3可行性分析创新点

1导师对此项课题有系统、全面的认识与把握

2.已初步掌握动物饲养及实验操作的基本要领3.山西医科大学实验中心具备本实验相关条件创新之处及可行性分析4现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性、难治性炎症性肠病（IBD）的个案或系列病例报道,对常规治疗失败或有手术禁忌证的UC病人，FMT或许是不错的选择，但其作用机制尚不完全清楚研究基础前期研究工作积累（1）

导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富的临床经验，可为实验提供理论技术指导。（2）已参阅大量与课题相关的中英文文献及与本课题参考性较强的相关资料和理论。硬件设施基本完备我校生理实验室具备完成本实验的基本条件：高速冷冻离心机、均浆机、超低温冰箱、氮气操作厨、，可以满足本课题的需求。动物中心实验室有饲养动物的动物房和饲养条件。预期结果

1.给予粪菌水的UC大鼠与给予无菌生理盐水的UC大鼠相比，血清TNF-α、IL-8检测值较小，说明前者的肠道炎症反应轻，通透性低，肠屏障功能相比后者较好。2.给予粪菌水的UC大鼠与给予无菌生理盐水的UC大鼠相比，结直肠损伤情况判定评分较低。经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由合计0.8科研业务费0.25查阅资料、发表论文实验材料费0.5动物饲养、化学试剂及耗材0.05仪器设备使用费参考文献主要参考文献：．参考文献

[1]邱新运,刘玉兰.粪菌移植在疾病治疗中的应用进展.中华内科杂志.2014,[2]BorodyTJ，KhomtsA．Fecalmicrobiotatransplantationandemergingapplication[J]．NatRevGastroenterolHepatol，2012，9：88-96．[3]Ord6sI，EckmannL，TalaminiM，eta1．Ulcerativecolitis．Lancet，2012，380(9853)：1606—1619．[4]FrankDN，RobertsonCE，HammcM，eta1．Diseasephenotypeandgenotypeareassociatedwithshiftsinintestinal．Associatedmicrobiotaininflammatoryboweldiseases[J].InflammBowel

is，2011，17：179—184．

[5]BorodyTJ，KhorutsA．Fecalmiembiotatransplantationandemergingapplications[J]．NatRevGastroentemlHepatol，2012．9(2)：88-96．[6]RoundJL，MazmanianSK．Thegutmicrobiotashapesintestinalimmuneresponsesduringhealthanddisease[J]．NatRevImmunol。2009，9(5)：313-323．[7]苏献恩，于文霞，王世宣．中华内科杂志，1993：12：842.[8]IshignroY．Mucosalproinflammatorycytokineproductioncorrelateswithendoscopicactivityofulcerativecolitis．JGastroenter01．1999；34：66．ol.53,NO.11.主要参考文献：参考文献

[9]SongAL.TheseveritycorrelationofTNF-α,IL-6andIL-8levelsinplasma

inpatientswithulcerativecolitisandtheirclinicalsignificances[J].ChinaPracMed,2008,3(36):3-4.[10]PearlDS,ShahK,WhittakerMA,etal.Cytokinemucosalexpressioninulcerativecolitis,therelationshipbetweencytokinereleaseanddiseaseactivity[J].JCrohnsColitis,2013,7(6):481-489.[11]EisemanB，SilenW，BascomGS，eta1．Fecalenemaasanadjunctinthetreatmentofpseudomembranousenterocolitis[J].Surgery，1958，44：854-859．

[12]FeingoldKR，MoserA，PatzekSM，eta1．Infectiondecreasesfattyacidoxidationandnuclearhormonereceptorsinthediaphragm．