色谱分离资料讲解

色谱分离色谱概述色谱（chromatography）分离技术是一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、层离法等。它是利用不同组分在固定相和流动相中的物理化学性质的差别，使各组分在两相中以不同的速率移动而进一步分离的技术。色谱概述加样，洗脱剂冲洗各组分与固定相无作用力——与洗脱剂一起流动，得不到分离；各组分与固定相有一定作用力——移动速率低于流动相。各组分与固定相的作用力大小不同——移动速率不同，作用力大，移动慢，各组分得到分离。1903年Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同，一般分离需要几小时至几天。◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱）和薄膜色谱法。特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（GC)

特点：以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（HPLC）。色谱概述色谱概述1941

Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952

James和Martin发展了气相色谱；1956

VanDeemter提出速率理论；1967

Kirkland等研制高效液相色谱法；80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。色谱概述几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。色谱流程及主要部件操作术语：①洗脱剂——作为流动相的液体。②层析剂——分离技术中的固定相③展开——加入洗脱剂而使各组分分层的操作。④色谱图——展开后各组分的分布情况。⑤洗脱液——洗脱时从柱中流出的溶液。色谱概述层析柱——径高比（10：1—1：100）、材质（玻璃、有机玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－10MPa）等泵——恒速、压力（蠕动泵等）馏分收集仪检测仪通用型—示差折光、介电常数、电导等专用型—紫外、荧光、放射性检测器等记录仪、工作站—色谱参数的选择和设定、自动化操作、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理、自动打印出一套完整的色谱分析数据……

色谱概述色谱概述岛津高效液相检测器SPD-20A/V紫外可见双波长检测器SPD-M20A二极管阵列检测器（PDA）RF-20A/xs荧光检测器RID-10A示差折光检测器CDD-10Avp电导检测器ELSD-LTⅡ蒸发光散射检测器ECD电化学检测器RadiochromatographyDetector放射性同位素检测器色谱法的优点（1）分离效率高。（2）应用范围广。（3）分析速度快。（4）样品用量少。（5）灵敏度高。（6）分离和测定一次完成。和多种波谱分析仪器联用（7）易于自动化，可在工业流程中使用。色谱概述色谱法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作。色谱法的分类根据操作压力的不同分类：低压色谱：操作压力<0.5MPa中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa高压色谱：操作压力4.0～40MPa色谱法的分类吸附色谱吸附色谱法(adsorptionchromatography，AC)是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附色谱的固定相为固体吸附剂，如有较强极性硅胶、中等极性氧化铝、非极性炭及特殊作用的分子筛等。吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离的方法。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化学键。吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂。基本原理吸附色谱吸附色谱分离过程示意图

下列三个化合物用硅胶吸附色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脱，判断三者流出色谱柱先后顺序。

ABC由先到后：

C→B→A

吸附色谱选用吸附色谱法分离化合物时，必须首先了解被分离化合物的性质，然后选择合适的吸附剂和展开剂。被分离化合物、吸附剂和展开剂三者关系配合恰当才能得到较好的分离效果。吸附剂与展开剂吸附色谱薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰胺。色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒度范围，不同吸附剂用于分离不同类型的化合物。吸附剂还必须具有一定的活度，活度太高或过低都不能使混合物各组分得到有效的分离。在吸附色谱中，组分的展开过程涉及吸附剂、被分离化合物和溶剂三种之间的相互竞争。其基本原则主要有两个：①展开剂对被分离组分有一定的解吸能力，但又不能太大。②展开剂应该对被分离的物质有一定的溶解度。常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸展开剂吸附色谱吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对欲分离的不同物质应该有不同的解吸能力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀，在操作过程中不会破裂。吸附剂与洗脱机选择的选择吸附色谱洗脱剂原则上要求所选的洗脱剂纯度合格，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，容易流动，容易与洗脱的组分分开。吸附色谱常用的洗脱剂饱和的碳氢化合物、醇、酚、酮、醚、卤代烷、有机酸等。选择吸附剂时，可根据样品的溶解度、吸附剂的种类、溶剂极性等方面考虑，极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的作洗脱剂，使组分容易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分容易从吸附柱中洗出。吸附色谱影响吸附分离的因素①和功能基极性有关。极性增加的顺序：烷烃、不饱和烃、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸，同一类化合物极性基团越多，极性越。②小分子的化合物比大分子的化合物极性大。③和某些细微结构有关，如氢键、异构体等。吸附色谱薄层吸附色谱分离操作（1）薄层色谱板的制备（2）点样（3）展开（4）显色干法铺板(软板制备)

多用于氧化铝薄层板的制备。在一块边缘整齐的玻璃板上，铺上适量的氧化铝，取一合适物品顶住玻璃板右端。两手紧握铺板玻璃棒的边缘，按箭头方向轻轻拉过，一块边缘整齐、薄厚均匀的氧化铝薄层即成。1）薄层色谱板的制备吸附色谱湿法铺板可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板的制备，但最常用的是硅胶硬板。为使制成的硅胶板坚硬，要加入黏合剂，用硫酸钙为粘合剂铺成的板称为硅胶G板，用羧甲基纤维素钠作黏合剂铺成的板为硅胶-CMC板。吸附色谱用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少时，某些成分不能被检出；太多时容易产生拖尾现象，即每个斑点都拉得很长，互相重叠，不能分开。点样展开展开操作需要在密闭的容器中进行。配好展开剂，将展开剂（一般2～10mL）倒入层析缸。放置一定时间，待层析缸被展开剂饱和后，再迅速将薄层板放入，密闭，展开即开始，这样可防止边缘效应产生。另外，注意在薄板放入层析缸时，切勿使溶剂浸没样品点。当溶剂移动到接近薄层上端边缘时，取出薄板，划出溶剂前沿。吸附色谱上行展开法和下行展开法最常用的展开法是上行展开，就是使展开剂从下往上爬行展开；下行展开是使展开剂由上向下流动。由于受重力作用，下行展开移动较快。

单次展开法和多次展开法

单向展开法和双向展开法吸附色谱显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置(1)紫外线照射法(4)生物显迹法(2)喷雾显色法(3)碘蒸汽显色法显色吸附色谱洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱柱色谱3.1吸附剂的选择吸附剂要求：

不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用

吸附剂的粒度大小要均匀

柱色谱（ColumnChromatography）实验室常用⑴氧化铝（alumina）

氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的活性分为五级。

柱色谱（ColumnChromatography）活性氧化铝含水量（%）硅胶含水量（%）Ⅰ00Ⅱ35Ⅲ815Ⅳ1025Ⅳ153830酸性氧化铝（pH=5～4），适用于分离酸性化合物和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨基酸类等。中性氧化铝（pH＝7.5），适用与分离生物碱、挥发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。碱性氧化铝（pH9～10），适用于碱性，如生物碱和中性化合物的分离。⑴氧化铝（alumina）

柱色谱（ColumnChromatography）⑵硅胶（silicagel）

柱色谱（ColumnChromatography）吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键的羟基。羟基有结合型（Ⅰ）、活性型（Ⅱ）和游离型（Ⅲ）三种。它们可以与试样和洗脱剂分子中的极性基团或不饱和键产生氢键缔合而起吸附作用，其吸附性强弱为：

（Ⅰ）<（Ⅲ）<（Ⅱ）

柱色谱（ColumnChromatography）

如果将硅胶在200℃以上长时间强热后，则硅原子上结合的羟基发生脱水而形成硅氧烷型（Ⅳ），这种不含羟基的硅氧烷型的硅胶吸附性极差。

活性羟基在硅胶表面较小的孔穴中较多，水与硅胶表面的羟基形成水合硅醇，使其失去活性。因此需加热除去水分。最佳活化条件为105℃—110℃加热30分钟。

柱色谱（ColumnChromatography）

硅胶，通常视为酸性吸附剂。一般用来分离一些酸性和中性有机物。如有机酸、萜类、氨基酸、甾类和一些甙类。但是，对某些酸性弱的试样，在色层中有分解的危险。此外，对于碱性物质可发生不可逆吸附。因此，对一些碱性物质在使用硅胶进行层析时，有必要进行预实验。如在硅胶中拌入15％左右的硝酸银，这种加硝酸银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性，因此，常用它分离一些不饱和化合物。

柱色谱（ColumnChromatography）3.2洗脱剂的选择选择原则：

取决于样品各组分的极性；

极性小的组分用极性小的洗脱剂进行洗脱；

极性大的组分用极性大的洗脱剂进行洗脱。除单一溶剂外，也可采用混合溶剂，或采用梯度（开始是低极性溶剂，后面是高极性溶剂）极性大的洗脱剂对极性大和小的组分洗脱能力都很强

柱色谱（ColumnChromatography）凝胶色谱凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。它具有一系列的优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。凝胶色谱小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠凝胶色谱理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。凝胶色谱葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。它由葡聚糖Dextran交联而得。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸水后体积膨胀越大。凝胶色谱琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。它与葡聚糖不同，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.5～9，温度0～40℃。琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作用，不能用硼酸缓冲液。凝胶色谱是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的。其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH2~11范围稳定。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。凝胶色谱常用的疏水凝胶为聚甲基丙烯酸酯凝胶或以二乙烯苯为交联剂的聚苯乙烯(如StyrogelBio-Beads-S)凝胶。“Styrogel”商品有11种型号，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好。凝胶色谱多孔玻璃珠的化学和物理稳定性号，机械强度高，不但抵御酶及微生物的作用，还能够耐受高温灭菌和较强烈的反应条件。缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特性性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。凝胶色谱由聚丙稀酰胺和琼脂糖混合组成的载体已投入应用。它的特点是载体既有羟基又有酰胺基，并且都能单独与配基使用。但这类载体不能接触强碱，为了避免酰胺水解，使用温度不能超过40℃。凝胶色谱凝胶的预处理市售凝胶必须经过充分溶涨后才能使用，如果溶涨不充分，则装柱后凝胶继续溶涨，造成填充层不均匀，影响分离效果。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌、静置、倾去上层混悬液、除去过细的粒子。如此反复多次，直至上层澄清为止。超临界流体色谱SFC48定义：以超临界流体为流动相的流动相的色谱分析法，具有GC和HPLC的优点，适于分析GC不能分析的高沸点、低挥发性的试样。超临界流体：

在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体即不是气体，也不是液体，而是一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。491）性质介于液体和气体之间;气体的低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离；液体的高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质SFC的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过改变SFC的密度调节组分分离，超临界流体的密度与压力有关。超临界流体色谱SFC50SFC色谱柱：填充柱dp:

3~10μm,Lcol:

25cm,内径:几mm交联毛细管柱df:

0.05~1μm

,Lcol:

10~20cm,内径:0.05~1μm

SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物优点：无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；SFC的流动相：超临界流体色谱SFC51压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变：7.0→9.0×106Pa，则：C16H34的保留时间：25→5min。程序升压超临界流体色谱SFC52高压泵无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；检测器

可采用HPLC的检测器(UV,FL)，也可采用GC的FID检测器.超临界流体色谱SFC聚苯醚低聚物的SFC分析色谱柱：毛细管柱(10cm×63mi.d.)固定相：键合二甲基聚硅氧烷；流动相：CO2；柱温：120C；程序升压；SFC即可分析GC中不适用的高沸点、低挥发性样品和HPLC中缺少检测功能团的样品，它又比HPLC有更高的柱效和更快的分析速度。分析对象：天然产物、高聚物、表面活性剂等。超临界流体色谱SFC54SFC的三次起落：1960’s的先驱性研究；1980’s初形成浪潮，认为会掀起分析方法的革命；目前，大公司纷纷撤去SFC分离设备，放弃进一步发展的计划。缺点：整个体系都要在高压下进行；b.流动相的选择有限(CO2)；c.仪器制造复杂，昂贵；G.Guiochon(AmericanLab1998,(9),14~15)指出成功和普及并成为定量分析方法必须具备：⑴易于使用，操作费用低，⑵能够得到准确，可重复的定量结果，⑶要能够解决至少一个分析化学中的重要问题.如，1960’s的GC用于石油和石化产品分析；1970’s的HPLC用于药物、代谢物和生物化学品的分析。超临界流体色谱SFC55超临界萃取：基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差别，当超临界溶剂流过样品时，使分离组分溶解在超临界溶剂中。超临界流体有很好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且表面张力接近零，较容易渗透到固体的孔隙里，使分离效率和速度大为提高。常用的超临界流体在常压下多为气体，易同萃取溶质完全分离，使样品得到充分的浓缩而不干扰下一步的分析，

超临界流体色谱SFC56基本解决了溶剂对环境的污染萃取时间短:15~45min萃取更彻底可进行热敏样品及痕量样品萃取节省萃取费用超临界流体色谱SFC分析色谱工业制备色谱过载适当的分离度峰形不对称柱压降适中溶剂回收追求最低成本低进样量分离度、灵敏度尽可能高色谱峰形较对称色谱柱压降大溶剂废弃工业色谱的特点工业色谱模拟移动床模拟移动床色谱分离度速度回收率上载量以纯度、最低成本为出发点在四大要素之间寻求平衡点工业色谱柱工业色谱应用的基本原则工业色谱模拟移动床色谱rrrr固定相

选择工业色谱的分离介质类型(正相、反相、手性形状(球形、无规则)颗粒度粒径分布吸附性能(或交换容量)装填方式工业色谱模拟移动床色谱工业色谱活性炭硅胶(包括化学键合相硅胶)分子筛活性氧化铝多孔玻璃多孔氧化锆多孔二氧化钛多糖衍生化CSPs环糊精及衍生化CSPs

Pirkle型CSPs

酒石酸二酰胺型CSPs

大环抗生素类CSPs

蛋白质类CSPs螺旋型聚合物类CSPs工业色谱的分离介质有机质类手性填料无机质类大孔吸附树脂离子交换树脂

如：聚丙烯酸型纤维素型等凝胶

如：葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶模拟移动床色谱工业色谱工业色谱的分离介质n-Hexane

正己烷n-butylether丁基醚dilsopropylerher

二异丙基醚methylteriarybutylerther

三甲基丁醚di-ethylether

二乙基乙醚n-butanol正丁醇2-propanol2-丙醇1-propanol1-丙醇Ethanol

乙醇Methanol

甲醇Terahydrofuran

四氢呋喃Pyridine

吡啶Methoxyethanol

甲氧基乙醇极性(样品溶解性、色谱保留)理化性质(粘度、互溶性、UV和RI特性)安全性(挥发性、爆炸极性、毒性)价格回收能耗(沸点、蒸发焓)常用溶剂模拟移动床色谱模拟移动床（SimulatedMovingBedSMB）是一种可以用于层析、吸附、离子交换、梯度洗脱等一种连续运行的色谱设备主体；与吸附剂结合，多个单体柱组合，通过“模拟移动”工艺可以实现高效、廉价、连续分离。最基本功能：是能够实现分离技术工业化与连续化。模拟移动床色谱研究进展20世纪60年代发展起来的，主要用于石油化工产品的分离;1969年，美国UOP公司（环球石油公司）将SMB分离技术用于分离对二甲苯和间二甲苯;1993年，法国Seperex公司将SMB分离技术用于药物和精细化工领域;近些年，SMB分离技术研究主要集中在糖类分离、同分异构体分离、手性化合物分离等方面。模拟移动床色谱研究进展国际上糖醇工业中多数采用了SMB分离技术。并利用SMB进行脱色、除蛋白、离子交换和脱盐等。

德国研究与应用居世界领先地位；

美国、法国、日本应用的也比较成熟；

国外已遍及石油化工、食品、精细化工、生物发酵和医药等领域应用。

模拟移动床色谱工业化SMBsysteminAerojetFineChemicalsSMBsysteminDaicel模拟移动床色谱研究进展SMB通过料液进出口位置的依次、定时移动实现分离设备的模拟移动。模拟移动床色谱目前，我国生物、药物及农副产物中活性化合物的色谱分离纯化使用的是工业制备色谱。存在的瓶颈问题是：分离成本高、制备效率较低、设备造价高。为了改变这种现状，开始注重研究模拟移动床色谱分离技术（SMB）的应用。研究进展模拟移动床色谱可连续分离操作；可根据生物、药物活性成分的种类调试不同的分离方法（层析、离交、吸附等等）；制备效率高，提纯效果较一般工业制备色谱分离高出40%。运行成本低，使加工成本降50%，甚至80%。

SMB的特点模拟移动床色谱黑龙江省农产品加工工程技术研究中心

XZ20Z-36L型模拟移动床中试设备模拟移动床色谱SMB应用前景功能性物料制备（皂甙、异黄酮、糖甙……）高纯度食品配料、食品添加剂（果糖浆、低聚木糖……）医药石油……化工……模拟移动床色谱展望

SMB技术是一种先进的分离技术，但是由于其系统配置及操作参数的确定较为复杂，且长期为国外专利所垄断，售价极高，限制了它在我国的推广利用。随着生命科学、生物技术和医药技术的快速发展，各种高附加值的活性成分需要研究开发，越来越多的单体成份及手性药物需要分离；开发我国自主知识产权的SMB装置及这一先进技术装备的应用与工业放大是极有意义的。模拟移动床色谱南北“金银花”入典之战湖南省纪委预防腐败室副主任陆群在其新浪实名微博“御史在途”称，国家药典委把中国南方地区传承上千年的“金银花”更名为“山银花”后，给数以千万计的百姓造成重大经济损失。陆群指称这不是表面上的一个学术问题，中间存在黑幕，为此实名举报国家食药监总局。

中药指纹图谱借用DNA指纹图谱发展而来，最先发展起来的是中药色谱指纹图谱。中药色谱指纹图谱是一种综合的，可量化的色谱鉴定手段。借以鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。中药指纹色谱中药质量控制现状《中国药典》关于药材所收录的信息【浸出物】【炮制】【性味与归经】【名称】【性状】【鉴别】【检查】【含量测定】【功能与主治】【用法与用量】【贮藏】【来源】宏观特征鉴别微观特征鉴别生药学动物分类学植物分类学矿物学微生物分类学药物分析学经验鉴别定性鉴别含量测定指标成分、对照药材齐墩果酸、熊果酸、大黄酸、槲皮素、小檗碱目前中药质量控制的局限●缺乏化学对照品●化学对照品缺乏专属性●物质群体间的量化特征无法体现黄柏、黄连——小檗碱、巴马亭的比例人参、西洋参或三七——几种人参皂苷的比例●中药整体的用药的特色无法体现