基因操作原理04课件

第四章

大分子的分离和分析一、E.coli质粒DNA的分离和纯化1．质粒DNA的小量提取第一节

DNA的分离、检测和纯化1．质粒DNA的小量提取①步骤性原理在碱性条件下，线状DNA变性，质粒DNA维持环状，高盐条件下复性，除质粒DNA外，形成沉淀。②步骤细菌培养物的生长、时间、量细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化（苯酚/氯仿梯度离心）DNApurificationKit(QiaGen)二、DNA的电泳检测主要检测：分子量，含量及有无1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物常规熔点低熔点Gellingpoint25℃20-30℃Meltingpoint65℃电压迁移率与电压成正比

2kb应

5U/cm

电场方向单一方向负→正脉冲电场几百kb以上温度4℃-30℃，0.5%or低熔点4℃bufferTAETBETPE50mM(pH7.5～8.0)2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）优点:分离率高1bp,点样量高10g回收的DNA纯度高非变性:迁移率与序列和组成有关变性(尿素/甲醛):无关，分离探针，S1酸产物分析，DNA测序三、DNA片段的纯化（从agarose）1.低熔点agarose电泳gel+5voltris65℃5minphenolextractethanol2.透析袋，电洗脱法可用于5kb3.GlassMilk(bead)3MNaI溶液，bead吸附洗涤elute4.KitQiagen公司一个典型哺乳动物细胞约含10-5gRNA，其中80-85%为rRNA(28S,18S和5S/23S,16S,5S)三种类型)，其余15～20%主要由各种类型的低分子量RNA组成（如tRNA，核内小分子RNA等）。mRNA为总RNA的1～5%，3‘端有一个poly(A)尾，可与oligo(dT)-纤维素，吸附，亲和层析分离寡脱氧胸苷酸。第二节

RNA的分离、纯化和检测电泳槽:洗净,水冲洗,乙醇干燥3%H2O210min0.1%DEPCH2O水洗2．H2O：0.1%DEPC溶液：用DEPC水配制（注意有些药品，不能用DEPC,如Tris）3．其它如手套，保持干净、清洁（二）RNA酶抑制剂1．蛋白质抑制剂人胎盘RNase抑制剂2．氧铜核糖核苷复合物100%抑制（且抑制体外翻译）3．硅藻土，吸附RNase二、RNA的抽提1．文献法2．KitGibco/TR1ZOLReagent100ml99.8USD酚+异硫氰酸胍Qiagen/RNAeasy三、纯化1．蛋白质的去除（见上）2．DNA的去除DNaseI（RNasefree）inhibitor3．Kit4．梯度离心1．检测蛋白质分子量2．Westernblot3．N-torminalaminoacidsequence第三节

蛋白质的SDS第四节

分子杂交

molecularhybridization1.根据被杂交的对象分为Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)2.denature变性：热，极端pH，有机溶剂，尿素

annealing复性：互补单链重新配对恢复成双链为复性

hybridization杂交：同源单链重新配对恢复成双链为杂性4.转移

NitrocellulosemembraneNCnylonmembrane(chargedornot)6×SSC(orSSPE)转移buffer

毛细管电转移真空滤纸凝胶滤膜吸水纸玻璃板重物支持物500g时间:<1kb<1hr,>15kb>18hr2.杂交·

探针处理·

温度42℃50%甲酰胺·

时间6-8小时

探针：DNA,Oligo,随机DNA3.洗膜2×SSC/0.5%SDS15minRT0.1×SSC/0.5%SDS1hrat杂交温度（三）检测

X-filmor生化

Phosphorimage（四）探针的标记probelabeling1．均一标记切口平移nicktraslation:E.coliDNApolyI随机引物randomprimer:

6Ntor6～12ntklenow2．单链探针ssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探针RNA探针，RNApolymerase3．末端标记

Klenow

标记3’端,补平和置换反应

T4polymerase标记3’端

3’-5’外物活性强，特别适用于3’突出末端

Kinase

标记5’端

正反应

32P→5’-OHNNNN→5’pNNNN

交换反应

过量ATP使5’-P→ADPthen32P→5’

末端转移酶标记3’4．寡核苷酸Kinase末端转移酶5．标记物放射性:32P，33P，35S非放射性:DIGoxigeninBiotin标记dUTP(五)DIG标记/检测举例1.探针标记6Nt随机寡核序列苷酸引物,Klenow标记2．检测

漂洗blocking免疫反应labeledAnti-DiG-Ab-Ap洗涤显色反应化学发光检测NBT-BCIP形成棕黄色沉淀BCIP：5-溴-4-氯-3’吲哚磷酸NBT:氯化硝基四氮唑蓝（染料色素）CIP的底物,也称氮蓝四唑优点：无污染，方便，探针可重复使用，可控制显色反应，保存杂交膜，易辩别真假阳性缺点：灵敏度不够，不能多次杂交，只有0.1pg可检测单拷贝，如g人胎盘DNA中的单拷贝二、原位杂交菌落杂交和空斑杂交1.菌落生长点种:将阳性重组子二个平板上(有/无膜)加CK影印:菌落和空斑，绝大多数应为重组子(白色菌落)2．DNA的释放与固定

有多种方法①10%SDS；②0.5NNaOH/1.5NNaCl③0.5MTris1.5NNaCl④SSC⑤干燥⑥固定80℃2hr三、斑点杂交类似上述方法，直接将DNA样品点在杂交膜上。四、Northernblot类似于Southernblot但用于检测RNA的分子杂交技术,用于分析总RNA或mRNA。1．电泳缓冲液①甲醛buf(5×)0.1mMMOPS(pH2.0)(3-(N-玛琳代)丙磺酸)40mMNaAc5mMEDTA(pH8.0)DEPCH2O②制胶甲醇（MW30.03）通常为37%水溶液，12.3M（pH>4.0）终浓度，1×buf+2.2M甲醇2．上样

预处理RNA（upto30g）4.5l+5×buf2.0l

甲醛3.5l甲酰胺10l65℃15minloadingbuf50%甘油，1mMEDTA(pH8.0)0.25%BPB0.255二甲苯TFF3．电泳loading之前，预电泳5min5V/cm

电泳1～2hr后，混合正负极电泳液4．转膜·预处理①DEPCH2O洗涤去除甲醛②ifagarose>10%or厚度>0.5cmor>2.5kb

需用0.05MNaOH处理20min,部分水解RNA③

无RNaseH2O洗涤,20×SSC浸泡45min·转移,同Southern五、Westernblot基本原理同其它blot方式,检测蛋白质与Southern的关键区别在于探针性质:抗体(一)抗体的要求1．单克隆抗体但并非都适合，由于靶蛋白已变性。2．多克隆抗体抗体为混合物，对其特异性,亲和力及浓度都一无所知对由SDS/还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别应做预备实验(二)简要步骤1．样品制备SDS样品2．runningSDS3．蛋白质转移硝酸纤维素滤膜，电转移:三夹板/隔离电极板干燥4．染色丽春红Sor印度墨水（射启性检测适用）但现少采用，由于有prestainMWmarker5．封闭背景脱脂奶粉5%6．第一抗体与靶蛋白结合7．二级免疫反应抗免疫球蛋白抗体或A蛋白A蛋白可与IgG的Fc片段binding木瓜蛋白酶切割IgGFragmentantigenbinding,Fragmentcrystalline

标记：125I碱性磷酸酶辣根过氧化物酶偶联8．检测辣根（HRP,horseradishperoxidase）

与3.3-二氨基联苯胺作用形成

棕色沉淀