血清成分的生化分析3教案资料

血清成分的生化分析3（一）谷丙转氨酶活性的鉴定——纸层析法实验材料鸡：三黄鸡血清及肝脏乌骨鸡血清及肝脏一.实验目的用纸层析法鉴定GPT的转氨活性二、实验原理观察肝脏中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肝肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。【一】谷丙转氨酶提取液制备

2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg，在低温下，研磨成浆，用脱脂棉（或双层纱布）过滤，得提取液。三、实验操作试剂对照管测试管1测试管20.1moL/L谷氨酸0.500.500.500.1moL/L丙酮酸钠0.500.500.500.1%KHCO3

0.500.500.500.025%溴乙酸

0.250.250.25煮沸的酶液0.50－－酶液－0.500.50加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物2%乙酸6滴6滴6滴沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析【二】转氨作用【三】纸层析1、方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆通过中心将滤纸绘成五等分扇形，用毛细管点样2～4次（直径不超过2mm）在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1～2mm取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h）80～100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮正丁醇溶液80～100℃显色2、实验结果标准Ala标准Glu对照管测试管1测试管2（二）血清谷丙转氨酶活力单位测定——分光光度法一、目的了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。二、实验原理

生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，其种类甚多，又以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（谷丙转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下：正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎、心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。注：本实验用鸡血清测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。

三、实验器材1、试管及试管架2、吸管3、恒温水浴4、分光光度计四、实验试剂1、0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）：250mL2、2.0μmol/mL丙酮酸钠标准液：40～50mL

取分析纯丙酮酸钠11mg，溶于50mL磷酸缓冲液中（当日配制）。3、谷丙转氨酶底物：150mL取分析纯α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g置于小烧杯内，加1mol/LNaOH溶液约10mL使其完全溶解，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整pH至7.4，加磷酸缓冲液定容至100mL。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每mL含α-酮戊二酸2.0μmol，丙氨酸200μmol。在冰箱中可保存一周。4、2，4-二硝基苯肼溶液：150mL在200mL锥形瓶内放入分析纯2，4-二硝基苯肼19.8mg，加100mL1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色瓶中，置冰箱内保存。5、0.4mol/LNaOH溶液：1200mL6、鸡血清：6mL五、实验操作【一】标准曲线的绘制试剂（mL）试管号012345丙酮酸钠标准液－0.050.100.150.200.25谷丙转氨酶底物0.500.450.400.350.300.25磷酸缓冲液（pH7.4）0.100.100.100.100.100.10充分摇匀后，置于37℃水浴，保温10min2，4-二硝基苯肼0.500.500.500.500.500.50充分摇匀后，置于37℃水浴，保温20min0.4mol/LNaOH5.005.005.005.005.005.00充分摇匀，室温静置10min后，520nm波长下比色A520nm值各管所含丙酮酸量（μmol）00.100.200.300.400.50各管相当于酶的活力单位数0100200300400500以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线注：（1）丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度（2μmol/mL）；（2）GPT活力单位为：每mL血清在37℃与pH=7.4的基质液作用60min，生成1μmol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果×1000即可。【二】酶活力的测定试剂（mL）测定管1测定管2对照管0GPT基质液（mL）0.50.50.537℃水浴，预温10min血清（mL）0.100.10－充分摇匀后，置于37℃水浴，保温30min2，4-二硝基苯肼0.500.500.50血清（mL）－－0.100.4mol/LNaOH（mL）5.005.005.00摇匀后，室温静置10分钟，520nm波长下比色A