微生物细胞的破碎技术

微生物细胞的破碎技术第一页，共三十二页，2022年，8月28日

胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身：单细胞蛋白（SCP）胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等1.微生物细胞的破碎技术概述第二页，共三十二页，2022年，8月28日2.细胞壁的组成和破碎阻力细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。第三页，共三十二页，2022年，8月28日第四页，共三十二页，2022年，8月28日第五页，共三十二页，2022年，8月28日第六页，共三十二页，2022年，8月28日第七页，共三十二页，2022年，8月28日各种微生物细胞壁的结构与组成

第八页，共三十二页，2022年，8月28日3.微生物细胞的破碎技术

第九页，共三十二页，2022年，8月28日高压匀浆法高压匀浆器采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂第十页，共三十二页，2022年，8月28日高压匀浆法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片细小，胞内物质释放完全适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎;不适合霉菌,因为容易造成堵塞;对革兰氏阳性菌破碎效果较差第十一页，共三十二页，2022年，8月28日影响因素操作压力（50～70MPa）细胞浓度（20％）温度循环次数(2~5)第十二页，共三十二页，2022年，8月28日高压匀浆器第十三页，共三十二页，2022年，8月28日第十四页，共三十二页，2022年，8月28日珠磨法

珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。第十五页，共三十二页，2022年，8月28日高速珠磨机第十六页，共三十二页，2022年，8月28日珠磨法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片较小，胞内物质释放完全温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类第十七页，共三十二页，2022年，8月28日影响细胞破碎的因素搅拌速度（700～1450r/min）料液的循环速度（50～500L/h）细胞浓度（0.3～0.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.45～1mm；70％～90％)第十八页，共三十二页，2022年，8月28日超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。影响因素:功率、发射时间、次数、细胞悬浮液体积对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。第十九页，共三十二页，2022年，8月28日电声超声波发生器第二十页，共三十二页，2022年，8月28日

化学法

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化学法采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有胆酸盐、磷脂、SDS、CTAB、有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等

第二十二页，共三十二页，2022年，8月28日化学法优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点，故使用较多。缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难总结：①酸碱容易造成产物水解或变性，慎用；②表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂适合于绝大部分非蛋白类的物质；

第二十三页，共三十二页，2022年，8月28日

酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。第二十四页，共三十二页，2022年，8月28日渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。第二十五页，共三十二页，2022年，8月28日冻结-融化法将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。第二十六页，共三十二页，2022年，8月28日干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。第二十七页，共三十二页，2022年，8月28日机械破碎法与非机械法比较

第二十八页，共三十二页，2022年，8月28日4破碎方法的选择细胞的量破碎条件——目标产物对破碎条件的敏感性破碎目标——待破碎细胞的机械强度第二十九页，共三十二页，2022年，8月28日破碎率的测定1.直接测定法2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率第三十页，共三十二页，2022年，8月28日破碎技术的新进展①多种破碎方法相结合：冻融法与匀浆法结合破碎酵母，有效提高破碎率②与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞③将细胞破碎与后续分离结合：珠磨法与双水相萃取第三十一页，共三十二页，2022年，8月28日5.基因工程表达产物的后处理

——包含体的分离与